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89210
ARC (D7Q3G) Rabbit mAb (PE Conjugate)

ARC (D7Q3G) Rabbit mAb (PE Conjugate) #89210

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H 内源性 兔 IgG
流式细胞术

使用 ARC (D7Q3G) Rabbit mAb (PE Conjugate)(实线)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (PE Conjugate) #5742(虚线),对 Daudi 细胞(蓝色)和 MCF7 细胞(绿色)进行流式细胞分析。

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针对需甲醇通透的直标抗体的实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要配制 1 L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中,混合均匀。
  2. 16‭‬% 甲醛(无甲醇)
  3. 100% 甲醇
  4. 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解于 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. 固定

注意:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。添加甲醛并使其终浓度为 4% 。
  3. 在室温下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上孵育 30 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。
  2. 通过离心分离,用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的直标抗体(按照建议的稀释度在孵育缓冲液中制备)中重悬细胞。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 通过离心分离,用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 1X PBS 中重悬细胞并用流式细胞分析仪进行分析;或者,如要进行 DNA 染色,那么继续进行可选的 DNA 染色(参见 E 部分)。

E. 可选 DNA 染料

  1. 在 0.5 ml 的 DNA 染料(例如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087)中重悬细胞。
  2. 室温孵育至少 5 分钟。
  3. 用流式细胞术分析 DNA 染色液中的细胞。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2017 年 6 月

实验步骤编号:407

应用 稀释度
流式细胞术 1:50
存储:

保存在 PBS (pH 为 7.2 )、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

ARC (D7Q3G) Rabbit mAb (PE Conjugate) 可识别内源水平的 ARC 总蛋白。

物种反应性:

使用与人 ARC 蛋白的 Pro125 周围的残基对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体,人 ARC 蛋白的 Pro125周围的残基是 NOL32 基因的同工型某一编码区域特有的。

Cell Signaling Technology 的这种抗体接合藻红蛋白 (PE),并可对人细胞进行直接的流式细胞分析内部检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 ARC (D7Q3G) Rabbit mAb #38916 相同。

具有 caspase 召集结构域的凋亡阻遏蛋白 (ARC),也被独立地鉴定为肌肉富集的胞质蛋白 (MYP),是一种调控凋亡的 CARD 结构域蛋白 (1)。ARC 蛋白 CARD 结构域与其他细胞死亡调节物(包括caspase-2、caspase-9、RAIDD 和 Apaf-1)中的结构域高度同源 (2)。NOL3 基因既编码胞质 ARC 蛋白,也编码一种参与 RNA 剪接的 30 kDa 核仁蛋白 (Nop30)。ARC 从 NOL3的亚型 2 编码,而通过选择性剪切产生的亚型 1 编码 Nop30。ARC 蛋白和 Nop30 蛋白有相同的氨基末端序列 (3)。调查研究表明,ARC 可以与胱天蛋白酶-8 和胱天蛋白酶-2 结合并通过参与受体蛋白 Fas、TNFR1、和 DR3 的內源通路抑制凋亡 (1)。进一步的研究表明,ARC 抗凋亡机制可能既包含固有(线粒体)通路也包含外来(死亡受体)通路 (4)。除结合 caspase 之外,ARC 还可以破坏与死亡结构域 Fas 和 FADD 的相互作用,这会抑制死亡诱导信号转导复合体 (DISC) 装配。ARC 的 CARD 结构域可以通过与促凋亡蛋白 Bax 结合来抑制固有凋亡 (5)。要导引 ARC 至线粒体,需要肌酸激酶 2 在 Thr149 位点磷酸化 ARC (6)。ARC 能够抑制程序性坏死,后者是一种在阻断向 TNFR1 召集 RIP1 时会触发的编程坏死通路 (7)。ARC 蛋白的表达在正常条件下主要见于终末分化的细胞中并且可在多种癌中被明显诱导,包括胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、黑色素瘤和急性髓性白血病(1、8-12)。

  1. Koseki, T. et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95, 5156-60.
  2. Hofmann, K. et al. (1997) Trends Biochem Sci 22, 155-6.
  3. Stoss, O. et al. (1999) J Biol Chem 274, 10951-62.
  4. Nam, Y.J. et al. (2004) Mol Cell 15, 901-12.
  5. Gustafsson, A.B. et al. (2004) J Biol Chem 279, 21233-8.
  6. Li, P.F. et al. (2002) Mol Cell 10, 247-58.
  7. Kung, G. et al. (2014) Cell Death Differ 21, 634-44.
  8. Mercier, I. et al. (2008) Cell Cycle 7, 1640-7.
  9. Wang, M. et al. (2005) FEBS Lett 579, 2411-5.
  10. Mercier, I. et al. (2005) Cell Death Differ 12, 682-6.
  11. Chen, L.H. et al. (2008) Cancer Res 68, 834-42.
  12. Carter, B.Z. et al. (2011) Blood 117, 780-7.
Entrez-Gene Id
8996
Swiss-Prot Acc.
O60936
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

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XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。

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