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86957
Akt (pan) (E7J2C) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)
偶联抗体
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Akt (pan) (E7J2C) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #86957

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以浓度匹配的 Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4843（虚线）作为对照，使用 Akt (pan) (E7J2C) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)（实线）对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。

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86957S		 100 µl （50 次测试）

定制制剂

支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa)
来源/亚型 小鼠 IgG2a

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体接合 Alexa Fluor® 647 荧光染料，并可对人体细胞进行直接的流式细胞分析内部检测。该抗体显示的物种交叉反应性预计与非偶联的 Akt (pan) (E7J2C) Mouse mAb #58295 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
流式细胞术 1:50

保存

保存在 PBS（pH 为 7.2）、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。不要分装抗体，避光保存，切勿冷冻。

实验步骤

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针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤（流式细胞术）

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛，不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604)：用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。

注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com/flowdyes，了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定

注：固定前，应分离黏附细胞或组织，并放在单细胞悬浮液中。

注意：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，这类抗体保持结合目的靶标。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀，并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物，并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者，细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度，以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。（通常，每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。）
  2. 通过离心分离，用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2019 年 8 月

实验步骤编号：407

特异性/敏感性

Akt (pan) (E7J2C) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 可检测 Akt 总蛋白的内源水平。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 Akt 中羧基末端周围的残基相对应的合成肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Akt 也称作 PKB 或 Rac，在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活，并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ，以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的 PDK2 可在 Ser473 处磷酸化 Akt ，它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标 (mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标（包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和 caspase-9）而抑制凋亡，进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3 激酶/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外，Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和 cyclin D1 降解 (14)，并通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16)，参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR，在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是，Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)（在 mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子）(18,19)。

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  2. Burgering, B.M. and Coffer, P.J. (1995) Nature 376, 599-602.
  3. Franke, T.F. et al. (1995) Cell 81, 727-36.
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  6. Jacinto, E. et al. (2006) Cell 127, 125-37.
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  18. Inoki, K. et al. (2002) Nat Cell Biol 4, 648-57.
  19. Manning, B.D. et al. (2002) Mol Cell 10, 151-62.

通路和蛋白

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