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5186
Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)

Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #5186

  1. 全部
  2. 类别：偶联抗体
  3. 产品

应用

反应性 敏感性 MW (kDa) 同型
H M R Mk Dm 内源性 兔 IgG
IF-IC
免疫荧光法（免疫细胞化学）

使用 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)（红色假色）和 Acetyl-Histone H3 (Lys9) (C5B11) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #9683（绿色），对经 LY294002 #9901（50 μM，2 小时；左图）处理或经胰岛素（100 ng/mL，15 分钟；右图）处理的 C2C12 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。

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流式细胞术
流式细胞术

以 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #2985（红色）作为对照，使用 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)（绿色）对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。

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免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100)：要配制 10 ml：添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中，混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。
  5. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意：甲醛有毒性，需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时，按照说明书中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  7. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2013 年 11 月

实验步骤编号：182

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针对需甲醇通透的直标抗体的实验步骤（流式细胞术）

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要配制 1 L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中，混合均匀。
  2. 16‭‬% 甲醛（无甲醇）。
  3. 100% 甲醇。
  4. 孵育缓冲液：将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解于 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. 固定

注意：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。添加甲醛并使其终浓度为 4% 。
  3. 在室温下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度，以通透细胞。
  2. 在冰上孵育 30 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。
  2. 通过离心分离，用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的直标抗体（按照建议的稀释度在孵育缓冲液中制备）中重悬细胞。
  4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
  5. 通过离心分离，用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 1X PBS 中重悬细胞并用流式细胞分析仪进行分析；或者，如要进行 DNA 染色，那么继续进行可选的 DNA 染色（参见 E 部分）。

E. 可选 DNA 染料

  1. 在 0.5 ml 的 DNA 染料（例如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087）中重悬细胞。
  2. 室温孵育至少 5 分钟。
  3. 用流式细胞术分析 DNA 染色液中的细胞。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2017 年 6 月

实验步骤编号：407

应用 稀释度
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:50
流式细胞术 1:50
存储：

保存在 PBS (pH 为 7.2 )、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。请不要分装抗体。避光保存。切勿冷冻。

Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) 可检测内源水平的 Akt 总蛋白。该抗体不与其他相关蛋白发生交叉反应。

物种反应性：

人,小鼠,大鼠,猴,黑腹果蝇

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种：

猪

使用与小鼠 Akt 中羧基末端序列周围的残基相对应的合成肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

Cell Signaling Technology 的这种抗体接合 Alexa Fluor® 647荧光染料，并可对人体细胞进行直接的流式细胞术和免疫荧光分析内部检测。该抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691 相同。

Akt也称作 PKB 或 Rac，在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活，并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ，以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的PDK2可在 Ser473 处磷酸化 Akt ，它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标（包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和caspase-9）而抑制凋亡，进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3 激酶/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外，Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和cyclin D1 降解 (14)，并通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16)，参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR，在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要的是，Akt 磷酸化并失活结节蛋白 (TSC2)（在mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制分子）(18,19)。

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  5. Sarbassov, D.D. et al. (2005) Science 307, 1098-101.
  6. Jacinto, E. et al. (2006) Cell 127, 125-37.
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  19. Manning, B.D. et al. (2002) Mol Cell 10, 151-62.
Entrez-Gene Id
207 , 208 , 10000
Swiss-Prot Acc.
P31749 , P31751 , Q9Y243
仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
本产品中的 Alexa Fluor 染料偶联抗体经 Life Technologies Corporation 许可销售，仅供研究使用，不可与 DNA 微阵列结合使用。The Alexa Fluor® 染料（除 Alexa Fluor® 430 染料外）是待审批的授权专利。Alexa Fluor® 是 Molecular Probes, Inc 的注册商标。
第 7,429,487 号美国专利，外国对应物，以及由此而来的儿童专利。

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