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蛋白质印迹法疑难排解指南

建议: 为了区分实验中可能造成问题的做法,请从以下常见事件列表中进行选择,这些事件可能导致蛋白质印迹法信号强度过高或不充分。

问题:高背景或额外条带

在印迹物短暂曝光于胶片后,总体背景高或出现非特异性条带。应当注意以下事实:基序抗体、翻译后修饰和剪接变体可能导致多个条带。

观看剪辑视频了解如何克服高信号问题

裂解物制备

新鲜制备的样品产生会更少的非特异性条带和降解条带,因此印迹结果更干净。通常,由于结缔组织,组织提取物往往会比细胞系提取物含有更多的背景条带和降解产物。使用新鲜、经过超声处理和澄清的组织提取物可降低背景。应将样品裂解于适当的缓冲液中,该缓冲液包含蛋白酶抑制剂和针对磷酸化目标的磷酸酶抑制剂(Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5870Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872Protease Inhibitor Cocktail #5871)。我们推荐使用适合于样品制备和蛋白质浓度定量的细胞裂解缓冲液 (#9803) 或 RIPA 缓冲液 (#9806),其中含有较强的去垢剂。SDS 上样缓冲液(#7722#7723)可用于无需蛋白质定量的全细胞裂解。Chaps Cell Extract Buffer (#9852) 用于制备细胞浆细胞组分,并且适用于研究 caspase 信号转导。Cell Fractionation Kit (#9038) 用于制备细胞浆、膜/细胞器和核/细胞骨架的细胞组分。

使用高质量硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose Sandwiches #12369)。一般推荐的孔隙大小为 0.2 µm;对于小于 30 kDa 的蛋白质,不推荐使用孔隙大小为 0.45 µm 的膜。PVDF膜可能产生比硝酸纤维素膜更高的背景。不推荐将尼龙 (Nylon) 膜用于蛋白质印迹法。在室温下,置于含有5% 脱脂奶粉的 TBST 中封闭 1 小时。

一抗稀释和/或孵育

使用推荐的封闭剂(5% BSA 或 5% 脱脂奶粉)以推荐的稀释度溶解于 TBST 中,在 4°C 下,过夜孵育一抗。对于单个抗体,请查询产品数据表找到推荐的稀释缓冲液。

洗涤不充分

在 TBST 中进行时间低于推荐的三次 5 分钟的洗涤很常见,并且可能导致高背景。我们推荐计时洗涤,以确保准确性。另外,低浓度 Tween® 20 可能导致高背景;我们推荐 0.1% Tween® 20。这适用于一抗和二抗孵育后的洗涤步骤。

二抗稀释和/或孵育

一些二抗与细胞提取物中的蛋白质非特异性地结合。若要评估二抗质量,可进行无一抗的印迹分析(胶片曝光检测)。可用相同的细胞提取物和一抗在印迹上进行二抗的梯度稀释,以优化二抗浓度。务必在室温下,在含有 5% 脱脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小时,用 BSA 稀释二抗会产生更高背景条带。CST™ 二抗已经过优化,无需滴定。

检测试剂

化学发光检测要求使用高纯度水来稀释浓缩试剂。只能使用不含有机或无机杂质的纯化水。我们推荐使用 RODI 水。此外,在检测试剂曝光前,确保膜在抗体孵育过程中决不变干。

曝光时间

超过 30 秒的胶片曝光时间会导致背景信号增高。为了避免长时间的曝光,使用蛋白质表达水平足够高的细胞系或组织和采用推荐的一抗孵育条件(参见一抗稀释和/或孵育部分)非常重要。如果有必要,运用处理手段诱导表达或修饰。

问题:低信号

在对胶片印迹进行短暂曝光后,不能检测到目的蛋白。

观看这些短片,了解如何克服低信号问题

裂解物制备

每道全细胞提取物的20–30 µg 总蛋白,通常足够用来检测。如果靶标蛋白的基础水平,或蛋白质修饰程度低,可能需要通过化学刺激剂来诱导表达或修饰。你可能要调查备选细胞系或组织,其所含的目的蛋白含量更高。应将样品溶解于适当的缓冲液中,该缓冲液包含蛋白酶抑制剂和针对磷酸化目标的磷酸酶抑制剂 (Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5870, Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872, Protease Cocktail #5871)。应务必对裂解物进行超声处理,以确保有效的染色质和膜结合靶标的蛋白质提取。请查看我们网站上的对照物表,获得推荐的阳性对照物和处理方法。

一抗稀释和/或孵育

使用推荐的封闭剂(5% BSA 或 5% 脱脂奶粉),以推荐的稀释度溶解于 TBST 中,在 4°C 下,过夜孵育一抗。使用备选封闭剂,如明胶、血清、无蛋白封闭剂、酪蛋白、或混合封闭剂,可能降低靶标信号强度。如需单个抗体的优化结果,请查询产品数据表找到推荐的稀释缓冲液。

SDS-PAGE 凝胶选择

一般来说,推荐采用 Tris-Glycine 凝胶。但是,对于高分子量蛋白质,我们推荐采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液。蛋白质从 1 毫米凝胶转移比从 1.5 毫米凝胶转移更有效。使用更厚的凝胶,可能会导致高分子量蛋白质的转移不完全,所以我们推荐监测转移效率,根据目的靶标蛋白质分子量大小,优化转移条件。

转移和膜

可通过延长转移时间或使用更高的电压,可改善转膜不完全。一般来说,我们建议在转移缓冲液中加入 20% 甲醇,然后在 70 V 电压下进行为时 2 小时的湿转。对于高分子量蛋白质,我们建议减少转移缓冲液中的甲醇至 5%,以提高转移效率并避免大分子蛋白质在凝胶基质中固定,并且在 70 V 电压下延长转移时间至 3 小时。检测较小的蛋白质时,可能在转膜期间出现过度转移(过膜蛋白质转移)问题。对于小蛋白质分子,使用孔隙大小为 0.2 µm 的膜并在 70 V 电压下进行为时 1.5 小时的湿转,而不是使用孔隙大小为 0.45 µm 的膜或进行过夜转移,这样做很重要,因为后者可能会导致过度转移和丢失小蛋白质分子信号。

封闭

膜封闭时间过长可能会掩盖抗原表位,并阻止抗体结合。在室温下仅封闭 1 小时。

洗涤

洗涤时间超过推荐的三次 5 分钟是一个常见问题,可能会导致减少信号。我们推荐计时洗涤,以确保准确性。TBST 应包含 0.1% Tween® 20。这适用于一抗和二抗孵育后的洗涤步骤。此外,我们建议在 TBST 中洗涤,因为已有数据显示在 PBST 中洗涤会导致减少信号。

二抗稀释和/或孵育

可用相同的细胞提取物和一抗在印迹上进行二抗的梯度稀释,以优化二抗浓度。务必在室温下,在含 5% 脱脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小时。避免在 HRP-偶联二抗的缓冲液中加入叠氮化钠,因为叠氮化物会抑制 HRP 的活性。CST™ 二抗已经过优化,无需滴定。

检测试剂

采用能用抗-生物素-HRP 进行检测的生物素化分子量标准作为化学发光检测的阳性对照物。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2013 年 11 月

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