对促销感兴趣? | 点击此处 >>

蛋白质印迹实验步骤(一抗在牛奶中孵育)

对于蛋白质印迹实验,在 4°C 下,将膜与稀释的抗体放在 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS、0.1% Tween-20 中孵育,轻轻搅动,过夜。

Cell Signaling Technology 提供的产品与各自的货号相关联。

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)。
  2. 1X SDS 样品缓冲液:#7722#7723):62.5 mM Tris-HCl(在 25°C 下 pH 为 6.8)、2% w/v SDS、10% 甘油、50 mM DTT、0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
  3. 转移缓冲液: 25 mM Tris 碱、0.2 M 甘油、20% 甲醇 (pH 8.5)。
  4. 10X Tris Buffered Saline (TBS): ( #9997) 要制备 1 L 的 10X TBS:24.2 g Tris 碱、80 g NaCl;用 HCl(使用 1X)将 pH 调节至 7.6。
  5. 脱脂乳粉: (#9999)(重量/体积 [w/v])。
  6. 封闭缓冲液:1X TBS、含有 5% w/v脱脂乳粉的 0.1% Tween-20;要制备 150 ml,添加 15 ml 10X TBS 到 135 ml 水中,混匀。添加 7.5 g 脱脂乳粉,混匀。搅拌时,添加 0.15 ml Tween-20 (100%)。
  7. 洗涤缓冲液:1X TBS、0.1% Tween-20 (TBS/T)。
  8. 一抗稀释缓冲液: 1X TBS、0.1% Tween-20、5% 脱脂奶粉;要配制 20 ml,添加 2 ml 10X TBS 到 18 ml 水中,混匀。添加 1.0 g 脱脂乳粉,混匀。搅拌时,添加 20 μl Tween-20 (100%)。
  9. Phototope®-HRP 蛋白质印迹检测系统: (#7071 抗兔) 或 (#7072 抗鼠) 包括生物素化蛋白梯、偶联辣根过氧化物酶 (HRP) 的二抗 (#7074 抗兔) 或 (#7076 抗鼠) 抗体、偶联 HRP 的抗生物素抗体、LumiGLO® 化学发光试剂和过氧化物。
  10. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format): (#7720)。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack: (#7727)。
  12. 印迹膜: 本实验步骤已针对 CST 建议的硝酸纤维素膜进行了优化。此外,也使用 PVDF 膜。

B. 蛋白质印迹

下面描述了样品制备的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10-15 秒后完成全细胞裂解,并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 将 20 μl 样品加热至 95-100°C,时长 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 用微量离心机分离 5 分钟。
  7. 上样 20 μl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

:CST 建议上样预染色的分子量标记物(#7720,10 µl/泳道),以验证电转移和生物素化蛋白梯(#7727,10 µl/泳道),从而测定分子量。

  1. 电转移至硝酸纤维素或 PVDF 膜。

C. 膜封闭和抗体孵育

:容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,请相应调整容量。

  1. (可选)转移后,在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。
  2. 膜在室温下用 25 ml 封闭缓冲液孵育 1 小时。
  3. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  4. 在 4°C 下,将膜和一抗(按照适当稀释度)放在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育,轻轻搅动,过夜
  5. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  6. 将膜与适当的 HRP 偶联二抗 (1:2000) 和 HRP 偶联抗生物素抗体 (1:1000) 放入 10 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时,轻轻搅动,以检测生物素化的蛋白标记物。
  7. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。

D. 蛋白质检测

  1. 将膜与 10 ml LumiGLO®(0.5 ml 20X LumiGLO®、0.5 ml 20X Peroxide 和 9.0 ml Milli-Q 水)放在室温下孵育 1 分钟,轻轻搅动。

:如果信号反应太快,则可进一步稀释 LumiGLO® 底物。

  1. 将膜上多余的显影液沥干(勿令其干燥),包裹在塑料膜中,然后用 X 射线胶片曝光。初步暴露 10 秒应视为适当的暴露时间。

:由于检测反应的动力学,信号在 LumiGLO® 孵育后立即变得最强,并在 2 小时后减弱。

发布​于 2005 年 6 月 

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink