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蛋白质印迹法实验步骤(荧光)

对于蛋白质印迹法,将膜与使用 5% w/v BSA 或脱脂奶粉的 1X TBS、0.1% Tween® 20稀释的一抗在 4°C 下孵育过夜,同时轻轻振摇。

:双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和标记有不同染料的二抗。表位重叠可能造成干扰,因而应当在双色蛋白质印迹法中加以考虑。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液,则在两种缓冲液中分别对每种一抗进行检验,以确定最适合进行双重标记实验的缓冲液。

A. 溶液和试剂

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。
  2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS):( #12498) 要制备 1 L 1X TBS:向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBS,然后混匀。
  3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ;通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:( #4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:向 900 ml dH2O 中添加100 ml 10X 电泳缓冲液,然后混匀。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:( #12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 转移缓冲液,然后混匀。
  6. 含 Tween® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST-10X):( #9997) 要制备 1 L 1X TBST:向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBST,然后混匀。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBS;要制备 150 ml,向 150 ml 1X TBS 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。Tween ® 20不应添加至封闭缓冲液中,因为它具有自发荧光并且能够增加非特异性背景。在封闭步骤之后,随后的稀释剂缓冲液中再添加 Tween® 20。
  9. 洗涤缓冲液:1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA):(#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:如一抗数据表上所示,含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉并充分混匀。
  12. 二抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g 脱脂奶粉并充分混匀。(二抗;抗兔 #5151#5366;抗小鼠 #5257#5470)。
  13. 预染蛋白质标准品,宽范围 (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜和纸:(#12369) 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化(推荐)。通常推荐 0.2 µm 孔径。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;使用冷的 1X PBS 洗涤细胞;吸取。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    :建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

:容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,请相应调整容量。

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。

    关键步骤:切勿在封闭缓冲液中加入 Tween® 20(A 部分,步骤 8)。

  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  4. 将膜和一抗(按照产品数据表中建议的适当稀释度)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  5. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  6. 将膜与荧光素偶联的二抗(#5470#5257#5366#5151)(稀释度为 1:5000-1:25,000 的 1 mg/ml 原液)在室温下于 10 ml 二抗稀释缓冲液中孵育 1 小时,并不时轻轻晃动。
  7. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

D. 蛋白质检测

  1. 将膜上多余的 TBST 沥干,可使其干燥。

    关键步骤:对于荧光染色,必须确保膜干燥。

  2. 请使用合适的荧光扫描仪并根据制造商的建议扫描膜。

发布​于 2008 年 5 月 

修订于 2016 年 6 月

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