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PathScan® 夹心 ELISA 抗体对实验步骤

A. 溶液和试剂

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。
  2. 洗涤缓冲液:1 X PBS/0.05% Tween® 20,(20 X PBST #9809)。
  3. 封闭缓冲液:1 X PBS/0.05% Tween® 20,1% BSA。
  4. 1X 细胞裂解缓冲液:10 X Cell Lysis Buffer ( #9803):为了制备 10 ml 1 X 细胞裂解缓冲液,添加 1 ml 10 X 细胞裂解缓冲液至 9 ml dH2O,混合。PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (#7018) 1 X:这种缓冲液如原样直接使用。两种缓冲液可以贮存在 4°C 以供短期使用(1–2 周)。

    推荐:使用之前即刻添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) ( #8553)。

    :关于裂解缓冲液推荐,请参考产品专用数据表或网页。

  5. 牛血清白蛋白 (BSA):(#9998)。
  6. TMB 底物:(#7004)。
  7. 终止液:(#7002)

    :每天都应制备新鲜试剂。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1,200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1,200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 包被程序

  1. 用 200 µl dH2O 淋洗微量平板,弃去液体。在纸巾上蘸干以确保各孔干燥。
  2. 在 1 X PBS 中 1:100 稀释捕获抗体。对于单块 96 孔板,添加 100 µl 捕获抗体母液至 9.9 ml 1 X PBS。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 4°C 孵育过夜(17–20 小时)。
  3. 在过夜包被后,轻柔地揭开平板的盖子,并洗涤各孔
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用洗涤缓冲液洗涤 4 次,每次 200 µl/孔。每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上,拍击力度要足够大,这样才能清除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
    3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  4. 封闭平板。添加 150 µl 封闭缓冲液/孔,盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  5. 在封闭后,洗涤平板(C 部分,步骤 3)。平板可直接使用。

D. 检测程序

  1. 裂解物可以不稀释使用或在封闭缓冲液中稀释使用。每孔添加 100 µl 裂解物。盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  2. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  3. 在封闭缓冲液中 1:100 稀释检测抗体。对于单块 96 孔板,添加100 µl 检测抗体母液至 9.9 ml 封闭缓冲液中。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 1 小时。
  4. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  5. 将二抗,即链霉亲和素抗小鼠或抗兔-HRP,在封闭缓冲液中 1: 1000 稀释。对于单块 96 孔板,添加 10 µl 二抗母液至 9.99 ml封闭缓冲液。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 30 分钟。
  6. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  7. 向每个孔中添加 100 µl TMB Substrate。盖住平板并在 37°C 孵育 10 分钟。
  8. 向每个孔中添加 100 µl STOP Solution。温和振摇数秒。
  9. 在微量平板读数仪上在 450 nm 吸光度读取平板。
    1. 目视测定:在添加 STOP Solution 后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度测定:用无绒织物擦拭孔的底面。在添加 STOP Solution 后 30 分钟内在 450 nm 读取吸光度。

发布​于 2008 年 1 月 

修订于 2013 年 9 月

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