对促销感兴趣? | 点击此处 >>

胞核通透染色

针对: PCNA (PC10) Mouse mAb #2586

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS): 将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶解在 800 ml dH2O 中。用 HCl 调节 pH 至 7.4 并调节体积至 1 L。室温储存。
  2. 无水甲醇
  3. 孵育缓冲液: 将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。
  4. 通透缓冲液: 添加 0.5% Triton X-100、0.2 µg/ml EDTA 和 1% BSA 到 PBS 中。

A. 细胞分离和固定

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 将细胞短暂重悬于 100 µl PBS 中。
  3. 添加 500 µl 透化缓冲液。在冰上孵育 15 分钟。
  4. 添加3 ml 冰冷的 100 % 甲醇并且间歇混合 10 分钟。
  5. 接着进行染色或在 -20°C 储存细胞。

B. 免疫染色

:对于单克隆抗体,使用同型匹配的对照组;对于多克隆抗体,使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将 0.5-1 x 106 个细胞分装入每个试验管(以体积计)。
  2. 添加 2-3 ml 孵育缓冲液至每根试管,随后通过离心分离润洗。重复操作。
  3. ​在每个测试管中加入100 μl 孵育缓冲液重悬细胞。
  4. 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
  5. 添加适宜稀释度的未接合、生物素酰化的或荧光物质接合的一抗至试管(适宜稀释度参见各抗体数据表)。
  6. 在室温下孵育一小时。
  7. 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
  8. 如果使用荧光物质偶联的一抗,则在 0.5 ml PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析;对于非偶联或生物素化一抗,继续进行步骤 D9。
  9. 在按建议稀释度用孵育缓冲液稀释的荧光物质偶联的二抗*或荧光物质偶联的亲和素中,重悬细胞。
  10. 在室温孵育 30 分钟。
  11. 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
  12. 将细胞重悬于 0.5 ml PBS 中并且在流式细胞仪上分析;或者,对于 DNA 染色,转至步骤 C1。

C. 可选 DNA 染色

  1. 在 0.5 ml 的 DNA 染料(例如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087)中重悬细胞。
  2. 在室温孵育至少 5 分钟。

用流式细胞分析仪分析 DNA 染色的细胞。

*推荐的二抗:

兔抗

鼠抗

抗大鼠

发布​于 2012 年 4 月 

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink