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KinomeView® 实验步骤

针对: KinomeView™ Profiling Kit #9812

:化学发光和 X 射线胶片检测系统已对 KinomeView™ 试剂盒中所含的所有基序抗体进行了验证。但如果需要高分辨率显影,则我们建议的显影平台为 LI-COR® Odyssey® 系统。

A. SDS-PAGE:

通常预制 4-20% 凝胶用于蛋白质印迹分析。

:预制凝胶应是新鲜的(自生产日期起短于 4 周)。根据我们的经验,使用超过 8 周的预制 PAGE 凝胶会使结果质量变坏。

B. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  • Cell Lysis Buffer (10X) #9803
  • SDS 样品缓冲液 (3X)、Blue Loading Buffer Pack #7722、Red Loading Buffer Pack #7723
  • 转移缓冲液: 25 mM Tris 碱、0.2 M 甘油、20% 甲醇 (pH 8.5)。
  • 10X Tris Buffered Saline (TBS): 要制备 1L 10X TBS:24.2 g Tris 碱、80 g NaCl;用 HCl(使用 1X)将 pH 调节至 7.6。
  • 10X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
  • Nonfat Dry Milk #9999
  • 封闭缓冲液(X 射线胶片): 1X TBS、0.1% Tween-20 (TBST) 和 5% w/v nonfat dry milk。
  • 封闭缓冲液 (LI-COR®): 1X TBS 和 5% w/v nonfat dry milk。
  • 洗涤缓冲液:1X TBS、0.1% Tween-20 (TBST)。
  • Bovine Serum Albumin (BSA) #9998
  • 一抗稀释缓冲液: 1X TBS、0.1% Tween-20 (TBST) 和 5% BSA。
  • 化学发光检测(包括二抗): Phototope®-HRP Western Blot Detection System、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7071、Phototope®-HRP Western Blot Detection System、Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7072。包括 Biotinylated Protein Ladder Detection Pack #7727、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074、Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076、Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075、20X LumiGLO® Reagent and 20X Peroxide #7003
  • DyLight® 偶联的二抗: Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight® 680 Conjugate) #5470、Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight® 800 Conjugate) #5257、Anti-rabbit IgG (H+L) (DyLight® 680 Conjugate) #5366、Anti-rabbit IgG (H+L) (DyLight® 800 Conjugate) #5151
  • Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720
  • 印迹膜: 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。

C. 样品制备和进行 SDS-PAGE

  1. 用 1X Cell Lysis Buffer (10X) #9803 裂解细胞培养物或组织样品,对裂解物进行声处理和离心分离,以使不可溶的细胞碎片沉淀。
  2. 检查裂解物的蛋白浓度。用 SDS-PAGE 上样缓冲液将裂解物蛋白浓度调节至 1-2 µg/µl,以制备上样母液。
  3. 给 SDS-PAGE 中每个泳道上样 20 – 30 µg 蛋白裂解物 (10 – 20 µl)。如果使用 X 射线胶片,则还在其中一个泳道上样 5 µl 预染色的标记物和生物素化标记物混合物。如果使用 LI-COR® Odyssey® 系统,则还在其中一个泳道中上样 5 µl 预染色的标记物。以 130 伏特对凝胶进行处理,直至染料到达凝胶底部。
    :生物素化标记物可使用抗生物素抗体检测;预染色的标记物在 LI-COR® Odyssey® 系统中自发荧光。
  4. 电转移至硝酸纤维素膜。

D. 膜封闭和抗体孵育

I. 膜封闭

  1. 膜用实验步骤专用封闭缓冲液室温孵育 1 小时,轻轻搅动。
  2. 用 TBS/T 稍微漂洗。

II. 一抗孵育

  1. 在 4°C 下,将膜与一抗 (1:1000) 放入一抗稀释缓冲液中孵育过夜,轻轻搅动。
  2. 用 TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。

III. 二抗孵育:

X 射线胶片:

  1. 将膜与相应物种 HRP 偶联二抗 (1:2000) 和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075 (1:1000) 放入封闭缓冲液中室温孵育 1 小时,轻轻搅动,以检测生物素化蛋白标记物。
  2. 用 TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 继续执行 E 部分的检测步骤。

LI-COR® Odyssey 系统:

  1. 将膜与相应物种染料偶联的二抗 (1:10,000) 放入 LI-COR® 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时,同时轻轻搅动。
  2. 用 TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 在室温下让膜干燥。膜干燥后,随后可直接扫描,或存放在室温下,供后续扫描。

E. 蛋白检测

X 射线胶片:

  1. 将膜与 10 ml LumiGLO®(0.5 ml 20X LumiGLO®、0.5 ml 20X Peroxide 和 9.0 ml Milli-Q 水)放在室温下孵育 1 分钟,轻轻搅动。
    :如果信号反应太快,则可进一步稀释 LumiGLO® 底物。
  2. 将膜上多余的显影液沥干(勿令其干燥),包裹在塑料膜中,然后用 X 射线胶片曝光。初步暴露 10 秒应视为适当的暴露时间。
    :由于检测反应的动力学,信号在 LumiGLO® 孵育后立即变得最强,并在 2 小时后减弱。

LI-COR® Odyssey® 系统:

  1. 用 Odyssey® 红外显影系统扫描膜。

LumiGlo® 是 Kirkegaard & Perry Laboratories 的注册商标。
LI-COR® 和 Odyssey® 是 LI-COR Biosciences 的注册商标。
DyLight® 是 Thermo Fisher Scientific, Inc. 及其子公司的注册商标。

发布​于 2011 年 3 月 

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