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细胞内蛋白质印迹法实验步骤

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):为了配制 1 L,添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。调节 pH 至 7.4。
  2. 甲醛, 16%, 无甲醇,Polysciences 公司出品。(货号#18814 ),使用新鲜制剂,小瓶打开后避光 4°C 保存,在 PBS 中稀释后使用。
  3. 封闭缓冲液:准备 25 ml 缓冲液,将 2.5 ml 10X PBS,以及1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 正常山羊血清 (#5425) ,正常驴血清)加入到 21.25 ml dH2O 中并混匀。搅拌时加入 75 µl Triton X-100 (100%)。
  4. 抗体稀释缓冲液: 要制备 40 ml 溶液,将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH2O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。搅拌时加入 120 µl Triton X-100 (100%)。
  5. 荧光素标记二抗。

:首次使用一抗或荧光素标记二抗时,将抗体滴定至最佳稀释比例,使样品在最少的背景干扰下,获得最强的特异性信号。

B. 固定和免疫标记

:对于每个抗体,请参考免疫荧光法实验步骤,以确定推荐的抗体特异性固定和通透化条件。

:细胞应当在多孔板上直接培养、处理、固定和染色。

:为避免单个孔中细胞分布不均导致的边界效应,将新接种的细胞板在室温下放置一小时,再放入 37°C 的孵箱中(更多信息请参考文献 Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 2003 8, 566–70)。

:为了将来自散射光和背景荧光的错误信号减到最小,请使用黑壁多孔板(例如 BD Falcon, 货号 353948)。

:避免移液器或吸引器接触到孔板内部,因为这样会留下人为假象,影响后续定量。相反,清空孔板时在废物缸上方将其倒置并剧烈摇晃,再用纸巾吸干。

:下面列出的体积适用于标准的 96 孔板。根据细胞板上或大或小的孔调整液体体积。

  1. 按需要在多孔板中培养和处理细胞。
  2. 按照抗体专用免疫荧光法实验步骤中的推荐,用 50 µl 4% 甲醛或 100% 甲醇固定细胞。
  3. 室温下固定细胞 15 分钟。
  4. 在废物缸上方将孔板倒置并剧烈摇晃,再用纸巾吸干。
  5. 使用室温 PBS(100 µl/每孔)将细胞板清洗三次,每次 5 分钟。
  6. 室温下用封闭缓冲液(50 µl/每孔)将细胞封闭一小时。
  7. 封闭样品时,可按照数据表中推荐的适用于免疫荧光 (IF-IC) 的比例,用抗体稀释缓冲液配制一抗。
  8. 倒出封闭液并加入已稀释的一抗(总体积 50 µl/每孔)。

:要进行双标,将小鼠来源和兔来源的一抗混合,并按其合适的稀释比例在抗体稀释缓冲液中稀释。

  1. 盖上细胞板并在 4°C 下过夜孵育。
  2. 用 PBS 清洗细胞板三次,每次 5 分钟。
  3. 将荧光标记二抗*在抗体稀释缓冲液中稀释(总体积 50 µl/每孔),然后在室温条件下避光孵育一小时。

:要进行双标,将荧光标记的鼠抗和兔抗二抗混合,并在抗体稀释缓冲液中稀释。

  1. 用 PBS 清洗细胞板三次,每次 5 分钟。
  2. 在缺乏基于抗体的解析时为标准化细胞数量,用 DRAQ5® 按 1:1000 在 PBS 中稀释后标记胞核(总体积 50 µl/每孔)。扫描之前,在室温条件下至少避光孵育 30 分钟。

:DRAQ5® 不能与 DyLight® 680 偶联二抗配合使用。DRAQ5® 的发射光谱和 DyLight® 680 重叠,无法区分每种染料产生的信号。

:为达到更佳的光学分辨率,可清空 DRAQ5® ,并用 PBS 清洗孔板至少一次。

  1. 根据制造商的说明书扫描孔板。(确保在扫描之前细胞板底部已擦干净)。

*推荐的二抗:

兔抗

鼠抗

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2019 年 1 月

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