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使用磁性分离法的免疫沉淀实验步骤(用于蛋白质免疫印迹分析)

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) (#9808)
  2. 1X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 10X 细胞裂解缓冲液加入到 9 ml dH2O 中,并混匀。

    :使用前,立刻加入 1 mM PMSF (#8553)。

  3. Protein A 或 G 琼脂糖珠: 使用蛋白 A (#73778) 进行兔蛋白沉淀,并用蛋白 G (#70024) 进行小鼠 IgG 沉淀。
  4. 3X SDS 样品缓冲液: Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) ;通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。
  5. 磁分离架:(#7017) 或 (#14654)

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
  6. 以 14,000 x g 的离心力在 4°C 下微量离心 10 分钟,然后将上清液转移到新试管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清(强烈建议)

强烈建议进行细胞裂解物预澄清步骤,以减少与蛋白 A 或 G 磁珠的非特异性蛋白结合。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。

  1. 稍微涡旋母液试管,以重悬磁珠。

    重要事项:使用前,预洗涤 #73778#70024 磁珠。

  2. 转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。

    一旦溶液变澄清,便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中,稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清,便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。

  3. 添加 200 μl 细胞裂解物到 20 μl 预先洗涤的磁珠中。

    重要事项:最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。

  4. 在室温下旋转孵育 20 分钟。
  5. 使用一个磁分离架将珠子与裂解物分离,并将预澄清的裂解物转移到一根干净的试管中,随后去除磁珠沉淀物。
  6. 继续进行免疫沉淀部分。

免疫沉淀

重要事项:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。使用 Normal Rabbit IgG #2729、Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 和 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 分别进行兔多克隆一抗、兔单克隆一抗和小鼠单克隆一抗的对照检测。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。

  1. 添加一抗(按产品数据表中建议的相应稀释度)到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜,从而形成免疫复合物。
  2. 预先洗涤磁珠(参见细胞裂解物预澄清部分,步骤 1 和 2)。
  3. 将裂解物和抗体(免疫复合物)溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
  4. 在室温下旋转孵育 20 分钟。
  5. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,同时洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  6. 在 20-40 μl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物,稍微涡旋以混匀,随后稍稍微量离心来让样品沉淀。
  7. 将样品加热到 95–100°C,并持续 5 分钟。
  8. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
  9. 将样品 (15-35 μl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
  10. 用蛋白质印迹法分析样品(参见蛋白质免疫印迹实验步骤:蛋白印迹实验 BSA蛋白印迹实验牛奶)。

:对于分子量为 50 kDa 的蛋白,我们建议将 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 用作二抗,以最小化变性重链产生的遮蔽效果。对于分子量范围约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 或 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127) 来最小化变性轻链产生的干扰。

发布​于 2011 年 12 月 

修订于 2017 年 10 月

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