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免疫沉淀法实验步骤/(针对变性蛋白)‭(IP/变性蛋白)

本实验步骤适用于变性蛋白的免疫沉淀法,此处变性蛋白的表位在天然构象中不可用

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 细胞变性裂解缓冲液: 50 mM Tris(pH 值7.5),70 mM β-硫基乙醇 (β-ME) ,使用前再加入 β-ME。预沸腾持续 10 分钟。
  2. 细胞裂解缓冲液 (1X): (#9803) 20 mM Tris(pH 值7.5)、 150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4和 1 µg/ml 亮抑酶肽

:使用前,立刻加入 1 mM PMSF。

  1. Protein A 或 G 琼脂糖珠: 将 Protein A (#9863)用于兔抗 IgG 沉淀实验,而 Protein G 用于鼠抗 IgG 沉淀实验。
  2. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 值6.8 ,25°C 条件),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在变性条件下收集细胞,去除培养基后,用 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (150 x 25 mm) 添加 0.4 ml 变性细胞裂解缓冲液(使用前,立即预沸腾 10 分钟)。
  4. 立即从板上刮除细胞并转移到 2.5 ml 管中。
  5. 沸腾持续 10 分钟。
  6. 加入 4 体积 (1.6 ml) 的 1X 冰上预冷细胞裂解缓冲液。这就是细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 将一抗加入到 200 µl 细胞裂解物中;轻柔震荡下在 4°C }过夜孵育。
  2. 加入Protein A 或 G 琼脂糖珠(20 µl 的 50% 珠浆)轻柔震荡下在 4°C 孵育 1–3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物 5 次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将样品加热到 95–100°C 并持续 2–5 分钟。
  6. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE 凝胶 (12–15%) 上。
  7. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2012 年 1 月

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