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免疫沉淀实验步骤(用于蛋白质免疫印迹分析)

如需更短的检测时间,请尝试使用我们的使用磁性分离法的免疫沉淀实验步骤(用于蛋白质免疫印迹分析)

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)
  2. 1X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4、1 µg/ml 亮抑酶肽

:使用前,立刻加入 1 mM PMSF。

  1. Protein A 或 G 琼脂糖珠: (Protein A #9863),请按照制造商的说明制备。使用蛋白 A 进行兔 IgG 沉淀,并用蛋白 G 进行小鼠 IgG 沉淀。
  2. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 值6.8 ,25°C 条件),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上可对样品进行 3 次超声粉碎,每次 5秒。
  6. 以 14,000 x g 的离心力在 4°C 下微量离心 10 分钟,然后将上清液转移到新试管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

可选: 可能需要进行裂解物预澄清步骤,以减少与蛋白 A/G 琼脂糖微珠的非特异性结合(见下文部分)。

  1. 取 200 μl 细胞裂解物,随后添加一抗。轻轻摇动,在 4°C 下孵育过夜
  2. 添加蛋白 A 或 G 琼脂糖微珠(20 μl 50% 珠浆)。轻柔震荡下在 4°C 孵育 1–3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液使沉淀物重新悬浮。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将样品加热到 95–100°C,持续 2-5 分钟,随后以 14,000 g 的离心力微量离心 1 分钟。
  6. 将样品 (15–30 μl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (12–15%) 上。
  7. 用蛋白质印迹法分析样品(参见蛋白质免疫印迹实验步骤:蛋白印迹实验 BSA蛋白印迹实验牛奶)。

细胞裂解物预澄清(可选)

  1. 取 200 μl 细胞裂解物并添加到蛋白 A 或 G 琼脂糖微珠(20 μl 50% 珠浆)中。
  2. 在 4°C 下孵育 30-60 分钟。
  3. 在 4°C 下旋转 10 分钟。将上清转移到新管中。
  4. 继续进行步骤 1 的免疫沉淀。

:对于分子量为 50 kDa 的蛋白,我们建议将 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678 用作二抗,以最小化变性重链产生的遮蔽效果。对于分子量为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2012 年 1 月

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