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免疫沉淀实验步骤(用于激酶检测分析)

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)
  2. 1X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4、1 µg/ml 亮抑酶肽

:使用前,立刻加入 1 mM PMSF。

  1. Protein A Agarose Beads: (#9863) 添加 5 ml 1X PBS 到 1.5 g protein A agarose beads 中。在 4°C 下搅动 2 小时,以 14,000 g 的离心力离心分离 1 分钟使其沉淀。沉淀物用 PBS 洗涤两次。在 1 体积的 PBS 中重悬珠子。
  2. 1X 激酶缓冲液: 25 mM Tris (pH 7.5)、5 mM β 甘油磷酸、2 mM DTT、0.1 mM Na3VO4、10 mM MgCl2

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10cm) 添加 0.5ml 1X 冰冷的细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上声处理三次,每次 5 秒钟。
  6. 在 4°C 下以 14,000 g 的离心力微量离心 10 分钟,随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

:对于使用固定一抗进行的免疫沉淀:添加 20 μl 固定的抗体珠浆到 200 μl 细胞裂解物中。轻轻摇动,在 4°C 下孵育过夜继续进行洗涤步骤 3。

  1. 添加一抗到 200 μl 细胞裂解物中;轻轻摇动,在 4°C 下孵育过夜
  2. 添加 protein A agarose beads(20 μl 50% 珠浆)。轻柔震荡下在 4°C 孵育 1–3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。沉淀物用 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤两次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 使用 500 μl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。

D. 激酶测定法

  1. 在 40 μl 1X 激酶缓冲液中重悬沉淀物,并再加入 200 μM ATP 和底物。
  2. 在 30°C 下孵育 30 分钟。
  3. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  4. 将样品加热到 95–100°C 并持续 2–5 分钟。
  5. 将样品 (15–30 μl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶中。
  6. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2012 年 1 月

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