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免疫组织化学实验步骤 - 针对产品:12692

针对: SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit #12692

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. Hematoxylin(可选)。
  5. 洗涤缓冲液

    :洗涤将需要其他 10X TBST。

    1. Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) #9997:要制备洗涤缓冲液,添加 100 μl Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) #9997 到 900 ml dH2O 中。或
    2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS):要制备 1 L,添加 24.2 g Trizma® 碱 (C4H11NO3) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH2O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。1X TBS/0.1% Tween® 20 (1X TBST):要制备 1 L,添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH2O 中。添加 1 ml Tween® 20 并混合。
  6. 抗体稀释剂SignalStain® Antibody Diluent #8112
  7. 抗原修复:10 mM 柠檬酸钠缓冲液:要制备 1 L,添加 2.94 g 柠檬酸钠三钠盐二水化物 (C6H5Na3O72H2O) 到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 6.0。
  8. 3% 过氧化氢:要制备,添加 10 ml 30% H2O2 到 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:1X TBST/5% normal goat serum:添加 100 μl 10X TBST (#9997) 和 50 μl normal goat serum (#5425) 到 850 μl dH2O 中。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114)。
  11. 基质:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059),包括 SignalStain® DAB Diluent (#11724) 和 SignalStain® DAB Chromogen Concentrate (#11725)。

B. 脱蜡/复水

:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

  1. 将玻片放入 10 mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 中煮沸,随后在亚沸温度下煮 10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 每块切片用 100-200 μl 封闭液室温封闭 1 小时。
  6. 清除封闭液,每块切片添加 100–200 μl 按 1:500 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释的一抗。4°C 孵育过夜。
    1. Rabbit (DA1E) mAb XP® SignalStain® Isotype Control (#3900) 用作阴性对照。按 1:500 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 稀释,并对每块切片用 100–200 μl。
  7. 让 SignalStain® Boost Detection Reagent (#8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要,在切片上滴 1-3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (#8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 使用前,添加 30 μl SignalStain® DAB Chromogen Concentrate (#11725) 到 1 ml SignalStain® DAB Diluent (#11724) 中,混匀。
  12. 每块切片用 100–400 μl SignalStain® DAB,并密切观察。通常,1-10 分钟即可产生可接受的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如有需要,按照制造商的说明用 hematoxylin 对切片进行复染色。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 脱水环节
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 封装盖玻片。

发布​于 2013 年 7 月 

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