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利用 SignalStain® Boost 检测试剂进行免疫组织化学实验步骤 - 适用于石蜡切片

重要事项:请参阅产品数据表首页或产品网页的应用板块,以确定该产品是否适用于石蜡包埋(IHC-P)的组织切片。

:请参见产品网页,了解合适的抗体稀释度、稀释剂和修复液。

A. 溶液和试剂

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇,组织级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 洗涤缓冲液
    1. 1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST):要制备 1 L 1X TBST,将 100 ml 10 X Tris 盐缓冲液带 Tween® 20 (TBST) (#9997) 加入 900 ml dH2O 中并混匀。
  5. *抗体稀释剂的选择:
    1. SignalStain® Antibody Diluent:(#8112)
    2. TBST/5% Normal Goat Serum:向 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    3. PBST/5% Normal Goat Serum:在 5 ml 1X PBST 中,加入 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
      • 1X PBST:要制备 1 L 1X PBST,加入 50 ml 带有 Tween® 20 (PBST) (#9809) 的 20 X 磷酸盐缓冲液至 950 ml dH2O 中并混匀。
  6. 抗体修复剂的选择:
    1. 1X 柠檬酸盐修复液:要制备 250 ml 的 1X 柠檬酸盐修复液,将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 用 225 ml 的 dH2O 进行稀释。
    2. 1X EDTA 修复液:要制备 250 ml 的 1X EDTA 修复液, 将 25 ml 的 SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) 用 225 ml 的 dH2O 进行稀释。
    3. TE:10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 值 9.0:要制备 1 L 溶液,将 1.21 g Tris 碱 (C4H11NO3) 和0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 加入到 950 ml 的 dH2O 中。调整 pH 值至 9.0,然后用 dH2O 将最终溶液定容至 1 L。
    4. 胃蛋白酶:Tris-HCl,1 mg/ml , pH 值 2.0。
  7. 3% 过氧化氢:要制备 100 ml 溶液,将 10 ml 30% H2O2 加入到 90 ml dH2O 中。
  8. 封闭液:1X TBST/5% Normal Goat Serum 或者 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. 1X TBST/5% Normal Goat Serum:将 250 µl Normal Goat Serum (#5425) 加入到 5 ml 1X TBST 中。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:在 4 mL 的 dH2O 中,加入 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  9. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125; HRP, Rabbit #8114)。
  10. 基质:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  11. 苏木精:Hematoxylin (#14166)
  12. 封固剂:SignalStain® Mounting Medium (#14177)

B. 脱蜡/复水

:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

:请参考选产品数据表,以了解针对修复液/实验步骤的指定推荐。

  1. 对于柠檬酸盐:将切片浸入1 X 柠檬酸盐修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度(95°-98°)10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。
  2. 对于 EDTA:将切片浸入 1 X EDTA 修复液,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度(95°-98°)15 分钟。无需冷却。
  3. 对 TE:将切片浸入 pH 值为 9.0 的 10 mM Tris/1 mM EDTA 溶液中,再放入微波炉中加热直至沸腾;继续保持亚沸腾温度(95°-98°)18 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。
  4. 对于胃蛋白酶:37°C 消化 10 分钟。

D. 染色

:请查询产品数据表,以了解推荐的抗体稀释剂。

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液,在室温下封闭 1 小时。
  6. 清除封闭液,然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。
  7. 4°C 孵育过夜。
  8. 将 SignalStain® Boost Detection Reagent 平衡至室温。
  9. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  10. 根据需要,滴入 1-3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent 覆盖切片。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  11. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  12. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  13. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB 并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  14. 将切片浸入 dH2O 中。
  15. 如果需要,按照说明书使用 Hematoxylin (#14166) 将切片复染。
  16. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  17. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  18. 用盖玻片和 SignalStain® Mounting Medium (#14177) 进行封片。

发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2016 年 10 月

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