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利用 SignalStain® Boost 检测试剂进行免疫组织化学的实验步骤 - 适用于冰冻切片

*重要事项:请参阅产品网页,以确定某种产品是否经验证以及是否获批用于冷冻组织切片。请参见产品网页,了解合适的抗体稀释度和修复液。

:请参见产品网页,了解产品特定的实验步骤建议。

A. 溶液和试剂

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 乙醇(无水变性,组织学分级 100% 和 95%)。
  3. 苏木精(可选)。
  4. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。
  5. 固定液选择:请参阅产品数据表,以了解最佳的固定液。
    1. 10% 中性缓冲福尔马林。
    2. 丙酮。
    3. 甲醇。
    4. 3% 甲醛:要制备 100 ml 溶液,将 18.75 ml 16% 的甲醛加入到 81.25 ml 的 1X PBS 中。
  6. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS) 洗涤缓冲液:(#12498) 要制备 1 L 1X TBS 溶液,将 100 ml 的 10X TBS 加入 900 ml dH2O 中,并混匀。
  7. 甲醇/过氧化物酶:制备方法:将 10 ml 30% H2O2 加入到 90 ml 甲醇中。储存于 -20°C 的温度下。
  8. 封闭液:1X TBS/0.3% Triton™ X-100/5% Normal Goat Serum (#5425)。制备方法:将 500µl 的山羊血清和 30 µl 的 Triton™ X-100 加入到 9.5 ml 的 1X TBS 中。
  9. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125; HRP, Rabbit #8114)。
  10. 基质:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。

B. 切片制作

  1. 针对储存在 -80°C 温度下的组织:切片前,从冷冻柜中取出组织样品,在 -20°C 的温度下均衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
  2. 将组织切成厚度在 6–8 µm 之间的切片,置于带正电荷的载玻片上。
  3. 固定前,将切片放置在工作台上风干几分钟(这样可以增加切片的粘附作用)。

C. 固定剂的选择

:请参考产品数据表,确定最佳的固定剂。

  1. 组织切片晾干后,按照以下步骤使用最佳的固定剂固定。
    1. 10% 中性缓冲福尔马林:在室温下固定10 分钟。立即进入染色步骤(D 部分)。
    2. 冷冻丙酮:-20°C 温度下,冷冻 10 分钟。风干。立即进行染色(D 部分)。
    3. 甲醇:-20°C 温度下,冷冻 10 分钟。立即进行染色(D 部分)。
    4. 3% 甲醛:在室温下固定15 分钟。立即进行染色(D 部分)。
    5. 3% 甲醛/甲醇:在3% 甲醛溶液中室温固定 15 分钟,之后在 -20°C 的温度下在甲醇溶液中固定 5 分钟(转移过程中不要冲洗)。立即进行染色(D 部分)。

D. 染色

  1. 用洗涤缓冲液清洗切片两次,持续 5 分钟。
  2. 在甲醇/过氧化物酶中室温孵育 10 分钟。
  3. 用洗涤缓冲液清洗切片两次,持续 5 分钟。
  4. 在每个切片上滴加 100–400 µl 封闭液,在室温下封闭 1 小时。
  5. 清除封闭液,然后每个切片加入用封闭液稀释的 100–400 µl 的一抗。
  6. 4°C 孵育过夜。
  7. 将 SignalStain® Boost Detection Reagent 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 根据需要,滴入 1-3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB,并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如有需要,可根据制造商的说明使用苏木精对切片进行复染。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 用盖玻片盖住切片。

发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2013 年 11 月

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