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免疫组织化学实验步骤(石蜡)

*重要提示: 请参阅产品数据表,了解相应抗体稀释剂和抗原修复流程。IHC 实验步骤: 修复缓冲液/抗体稀释剂。

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)
  3. 去离子水 (dH2O)
  4. Hematoxylin(可选)
  5. 洗涤缓冲液:
    1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST): 要制备 1 L,添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH2O 中。添加 1 ml Tween-20,混匀。
    10X Tris Buffered Saline (TBS): 要制备 1 L,添加 24.2 g Trizma® 碱 (C4H11NO3) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH2O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。
  6. *抗体稀释剂:
    1. SignalStain® Antibody Diluent #8112
    2. TBST/5% normal goat serum (#5425): 往 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl normal goat serum。
    3. PBST/5% normal goat serum (#5425): 往 5 ml 1X PBST 中添加 250 µl normal goat serum。
      1X PBS/0.1% Tween-20 (1X PBST): 要制备 1 L,添加 100 ml 10X PBS 到 900 ml dH2O 中。添加 1 ml Tween-20,混匀。
      10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要制备 1 L,添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4​g 磷酸一钾 (KH2PO4) 到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 7.4。
  7. *抗原修复:
    1. 柠檬酸: 10 mM 柠檬酸钠缓冲液:要制备 1 L,添加 2.94 g 柠檬酸钠三钠盐二水化物 (C6H5Na3O7•2H2O) 到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 6.0。
    2. EDTA: 1 mM EDTA:要制备 1 L,添加 0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 8.0。
    3. TE: 10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 值 9.0:要制备 1L,添加 1.21 g Trizma® 碱 (C4H11NO3) 和 0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 到 950 ml dH2O 中。调整 pH 值至 9.0,然后用 dH2O 将最终溶液定容至1000 ml。
    4. 胃蛋白酶: 在 Tris-HCl 中为 1 mg/ml,pH 2.0。
  8. 3% 过氧化氢: 要制备,添加 10 ml 30% H2O2 到 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液: TBST/5% normal goat serum (#5425):往 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl normal goat serum。
  10. 生物素化二抗。
  11. ABC 试剂: (Vectastain ABC Kit,加州伯林盖姆 Vector Laboratories, Inc.) 在使用前 30 分钟,按照制造商的说明制备。
  12. DAB 试剂或合适底物: 按照制造商的建议制备。

B. 脱蜡/复水

:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. *抗原修复

:请参阅产品数据表,了解有关修复液的具体建议。

  1. 对于柠檬酸: 将玻片放入 10 mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 中煮沸,随后在亚沸温度下煮 10 分钟。在实验台上冷却玻片 30 分钟。
  2. 对于 EDTA: 将玻片放入 1 mM EDTA (pH 8.0) 中煮沸,随后在亚沸温度下煮 15 分钟。无需冷却。
  3. 对于 TE: 将玻片放入 10 mM TE/1 mM EDTA (pH 9.0) 中煮沸,随后在亚沸温度下煮 18 分钟。在实验台上冷却 30 分钟。
  4. 对于胃蛋白酶: 在 37°C 下消化 10 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

:请参阅产品数据表,了解建议的抗体稀释剂。

  1. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  2. 每块切片用 100-400 µl 封闭液室温封闭 1 小时。
  3. 清除封闭液,然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。4°C 温度下孵育过夜
  4. 清除抗体溶液,并用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  5. 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗(根据制造商建议在 TBST 中进行稀释)。在室温孵育 30 分钟。
  6. 如果使用 ABC 亲和素/生物素方法,则根据制造商的说明制备 ABC 试剂,并在室温下孵育溶液 30 分钟。
  7. 清除二抗溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  8. 每块切片添加 100-400 µl ABC 试剂,并在室温下孵育 30 分钟。
  9. 清除 ABC 试剂,切片用洗涤缓冲液洗涤 3 次,每次5分钟。
  10. 向每块切片添加 100-400 µl DAB 或合适底物,并密切监测染色。
  11. 一旦形成切片,便将玻片浸入 dH2O 中。
  12. 如有需要,按照制造商的说明用 hematoxylin 对切片进行复染色。
  13. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  14. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  15. 封装盖玻片。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2008 年 2 月

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