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免疫组织化学实验步骤(石蜡) - 针对产品:3625

针对: NUT (C52B1) Rabbit mAb #3625

*重要提示: 参见产品数据表,了解相应的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)
  3. 去离子水 (dH2O)
  4. Hematoxylin(可选)
  5. 洗涤缓冲液:
    1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST): 要制备 1 L,添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH2O 中。添加 1 ml Tween-20,混匀。
    10X Tris Buffered Saline (TBS): 要制备 1 L,添加 24.2 g Trizma® 碱 (C4H11NO3) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH2O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。
  6. 抗体稀释剂: SignalStain® Antibody Diluent #8112
  7. 抗原修复: TE:10 mM Tris/1 mM EDTA pH 9.0:要制备 1L,添加 1.21 g Trizma® 碱 (C4H11NO3) 和 0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 到 950 ml dH2O 中。调节 pH 值至 9.0,然后用 dH2O 将最终溶液定容至 1000 ml。
  8. 3% 过氧化氢: 要制备,添加 10 ml 30% H2O2 到 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液: TBST/5% normal goat serum (#5425):往 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl normal goat serum。
  10. 检测试剂: SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114)
  11. DAB 试剂或合适底物: 按照制造商的建议制备。

B. 脱蜡/复水

:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

:本流程描述了使用 Biocare Medical Decloaking Chamber 所建议的条件。设备专用设置和操作说明应用于其它加压蒸煮器。

  1. 将切片放入 250 ml 室温存放的 TE 修复液中,并置于一个能放 24 个切片的切片夹上。
  2. 将 500 ml dH2O 倒入加压蒸煮器中。
  3. 将切片夹放入加压蒸煮器,直至接触到隔热板。再将一个能放 24 个切片的切片夹放入有 250 ml 水和空白切片的加压蒸煮器中,这样也许有好处。
  4. 密封蒸煮器室,并继续进行修复。以下为 Biocare Medical Decloaking Chamber 的设置。
    1. SP1 125°C 30 秒
    2. SP2 90°C 10 秒
  5. 小心给设备开排放口,随后取下盖子并将切片放在实验台上冷却 10 分钟。
  6. 用 dH2O 冲洗切片。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片 5 分钟。
  5. 每块切片用 100-400 µl 封闭液室温封闭 30 分钟。
  6. 清除封闭液,每块切片添加 100-300 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent #8112 中稀释的一抗。在室温下孵育 1 小时。请参阅产品数据表,确定建议的稀释度。
  7. 将 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 试剂平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,并用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 每块切片滴 1-2 滴 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114。在室温孵育 30 分钟。
  10. 清除 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 溶液,切片用洗涤缓冲液洗涤三次,每次 5 分钟。
  11. 向每块切片添加 100-400 µl DAB 或合适底物,并密切监测染色。
  12. 完成制备时,将玻片浸入 dH2O 中。
  13. 如有需要,按照制造商的说明用 hematoxylin 对切片进行复染色。
  14. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  15. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  16. 封装盖玻片。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2011 年 8 月

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