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免疫组织化学实验步骤(石蜡) - 针对产品:3287

针对: ROS1 (D4D6®) Rabbit mAb #3287

*重要提示: 参见产品数据表,了解相应的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. Hematoxylin(可选)。
  5. 洗涤缓冲液:
    1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST): 要制备 1 L,添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH2O 中。添加 1 ml Tween-20,混匀。
    10X Tris Buffered Saline (TBS): 要制备 1 L,添加 24.2 g Trizma® 碱 (C4H11NO3) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH2O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。
  6. 抗体稀释剂: SignalStain® Antibody Diluent (#8112)。
  7. 抗原修复: EDTA:1 mM EDTA:要制备 1 L,添加 0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 8.0。
  8. 3% 过氧化氢: 要制备,添加 10 ml 30% H2O2 到 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液: TBST/5% normal goat serum:往 5 ml 1X TBST 中添加 250 μl normal goat serum (#5425)。
  10. 检测系统: SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114)。
  11. 底物: SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。按照试剂盒的建议制备。

B. 脱蜡/复水

:务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

:本流程描述了使用 Biocare Medical Decloaking Chamber 所建议的条件。设备专用设置和操作说明应用于其它加压蒸煮器。

  1. 将切片放入250 ml 室温下的 1.0 mM EDTA (pH 8.0) 24 个切片夹内。
  2. 将 500 ml dH2O 倒入加压蒸煮器中。
  3. 将切片夹放入加压蒸煮器,直至接触到隔热板。再将一个能放 24 个切片的切片夹放入有 250 ml 水和空白切片的加压蒸煮器中,这样也许有好处。
  4. 密封蒸煮器室,并继续进行修复。以下为 Biocare Medical Decloaking Chamber 的设置。
    1. SP1 125°C 30 秒
    2. SP2 90°C 10 秒
  5. 小心给设备通风,随后取下盖子并将载玻片放在实验台上冷却 10 分钟。
  6. 用 dH2O 冲洗切片。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 封闭液,在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液,并给每块切片添加 100–300 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。在 4°C 温度下过夜孵育。
  7. 让 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 每块切片滴 1–2 滴 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114)。在室温孵育 30 分钟。
  10. 清除 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) 溶液,切片用洗涤缓冲液洗涤三次,每次 5 分钟。
  11. 每块切片添加 100–400 µl SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059),并密切监测染色。
  12. 完成制备时,将玻片浸入 dH2O 中。
  13. 如有需要,按照制造商的说明用 hematoxylin 对切片进行复染色。
  14. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  15. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  16. 封装盖玻片。

发布​于 2012 年 10 月 

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