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免疫组织化学实验步骤(冷冻)

A. 溶液和试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇(无水变性,组织级 100% 和 95%)。
  3. Hematoxylin(可选)
  4. 固定剂:如需了解最佳固定剂,请参阅产品数据表
    1. 10% 中性缓冲福尔马林
    2. 丙酮
    3. 甲醇
    4. 16% 甲醛
      1. 3% 甲醛: 要制备,添加 18.75ml 16% 的甲醛到 81.25 ml 的 1X PBS 中。
  5. 10X Tris Buffered Saline (TBS): 要制备 1 L,添加 24.2 g Trizma 碱 (C4H11NO3) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH2O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。
  6. 洗涤缓冲液: 1X Tris 盐缓冲液 (TBS);要制备 1L,添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH2O 中。
  7. 甲醇/过氧化物酶: 制备方法:将 10 ml 30% H2O2 加入到 90 ml 甲醇中。储存于 -20°C 的温度下。
  8. 封闭液: 1X TBS/0.3% Triton-X 100/5% normal goat serum (#5425)。要制备: 添加 500µl 羊血清和 30 µl Triton-X 100 到 9.5 ml 1X TBS 中。
  9. 生物素化二抗。
  10. ABC 试剂: (Vectastain ABC Kit,加州伯林盖姆 Vector Laboratories, Inc.)。在使用前 30 分钟,按照制造商的说明制备。
  11. DAB 试剂或合适底物: 按照制造商的建议制备。

B. 切片制作

  1. 对于储存在 -80°C 下的组织:尝试制备切片前,从冰箱中取出来,并在 -20°C 下平衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
  2. 将组织切成厚度在 6–8 µm 之间的切片,并将其置于带正电荷的载玻片上。
  3. 固定前,将切片放置在工作台上风干几分钟(这样有助于加强切片与载玻片之间的黏附)。

C. 固定

:参考产品数据表,确定最佳固定剂。

  1. 组织切片晾干后,按照以下步骤使用最佳的固定剂固定。
    1. 10% 中性缓冲福尔马林: 在室温下固定 10 分钟。立即进入染色步骤。
    2. 冷冻丙酮: 在 -20°C 下固定 10 分钟。风干。立即进入染色步骤。
    3. 甲醇: 在 -20°C 下固定 10 分钟。立即进入染色步骤。
    4. 3% 甲醛: 在室温下固定 15 分钟。立即进入染色步骤。
    5. 3% 甲醛/甲醇: 在 3% 甲醛中室温固定 15 分钟,之后在 -20°C 下用甲醇固定 5 分钟(中间不漂洗)。立即进入染色步骤。

D. 染色

  1. 用洗涤缓冲液清洗切片两次,持续 5 分钟。
  2. 在室温下,用在甲醇中稀释的 3% H2O2 孵育 10 分钟。
  3. 用洗涤缓冲液清洗切片两次,持续 5 分钟。
  4. 在室温下,每块切片用封闭液封闭 1 小时。
  5. 清除封闭液,并向每块切片加入 100–400 µl 稀释的一抗。(在封闭液中稀释抗体)。4°C 孵育过夜。*参阅产品数据表,确定建议的稀释度。
  6. 清除抗体溶液,用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  7. 向每块切片添加 100-400 µl 二抗,二抗根据制造商的建议在封闭液中稀释。在室温孵育 30 分钟。
  8. 如果使用 ABC 亲和素/生物素方法,则根据制造商的说明制备 ABC 试剂,并在室温下孵育溶液 30 分钟。
  9. 清除二抗溶液,切片用洗涤缓冲液洗涤 3 次,每次 5 分钟。
  10. 向每块切片添加 100-400 µl ABC 试剂,并在室温下孵育 30 分钟。
  11. 清除 ABC 试剂,切片用洗涤缓冲液洗涤 3 次,每次5分钟。
  12. 向每块切片添加 100-400 µl DAB 或合适底物,并密切监测染色。
  13. 一旦形成切片,便将玻片浸入 dH2O 中。
  14. 如有需要,按照制造商的说明用 Hematoxylin 对切片进行复染色。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 封装盖玻片。

发布​于 2006 年 1 月 

修订于 2006 年 4 月

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