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免疫组织化学 (IHC)

免疫组织化学 (IHC) 概述

免疫组织化学(或 IHC)是一种基于抗体的技术,用于检测结构和组织已保留的组织中的蛋白表达。Coons 等人于 1942 首次报告了 IHC 的使用,他们报告了开发荧光连接抗体来观察肺炎球菌。它广泛用于医学研究实验室以及临床环境中,以研究生物样品中是否存在抗原。这种技术依赖于一种抗体对某种表位的特异性检测。通常,这种特殊的结合关系需要进行一些优化才能获得准确结果。组织处理途径的多个方面可能会影响抗体与组织相互作用的方式,且应仔细调整以实现抗体与其特异靶蛋白的正常结合。

 

石蜡包埋组织切片的 IHC 实验步骤视频

什么是免疫组织化学?

IHC 利用抗体与抗原之间的关系,以显现蛋白表达原位。这种方法的独特之处在于它同时保留了一个组织样品的解剖和结构特征。这可以高分辨率地显现蛋白,及其在细胞以及各种亚细胞区室内的定位方式。简而言之,IHC 以一种相对简化直接,但极其通用的方式将免疫检测与先进的显微镜结合在一起。

何时使用免疫组织化学?

IHC 在临床环境中用来检测组织样品中的各种致病特征,例如瘤形成、转移、感染和炎症,以用于诊断目的。另外,IHC 通常用于生物医学研究以检测各种情境下的目的蛋白,此外还用于药物开发。

ALK (D5F3®) XP® 兔单克隆抗体 #3633

使用 ALK (D5F3®) XP® 兔单克隆抗体 #3633 对高水平(左图)与低水平(右图)表达 ALK 的石蜡包埋的人肺癌细胞进行免疫组织化学分析。

ROS1 (D4D6) Rabbit mAb #3287

使用 ROS1 (D4D6) Rabbit mAb #3287 对石蜡包埋的人肺癌细胞进行免疫组织化学分析。注:FIG-ROS1 融合蛋白出现染色 (Rimkunas, V.M. et al. (2012) Clin Cancer Res 18, 4449-4457.)

免疫组织化学如何工作?

如上所述,从最基本地来说,IHC 取决于抗体对组织样品中特异性目的蛋白的检测。但是,当然没有那么简单。首先,让我们大概看一下成功进行一次 IHC 实验所需的重要步骤,然后我们将更详细地查看每个步骤。

成功进行 IHC 的11 个实验步骤

在此,我们提供了我们所推荐的实验步骤的概述,并讨论我们认为对一次成功实验很关键的步骤。根据我们将 IHC 用作我们抗体验证和技术支持过程的广泛经验,我们提供有关试剂和流程的建议。IHC 是一项具有挑战性的应用,但是常常出现问题。本指南旨在提供建议来帮助您改进您的 IHC 分析,让您在终端用户优化最少的情况下获得预期结果。

请注意: 以下步骤是针对石蜡包埋的样品的实验步骤。

成功进行 IHC 的11 个实验步骤

成功进行 IHC 的11 个实验步骤

固定

IHC 的一个主要特点是使用多种可用固定剂中的一种来保存组织,以维持构成该组织的细胞的天然结构。所以经常被忽视但在任何 IHC 流程中都非常重要的第一步便是固定。可使用不同化学品将细胞和组织的蛋白锁入一个刚性结构中,从而为之前的活细胞创建一个固定构架。化学固定是一个最受欢迎的选择,但还存在其他选择,因此应认真考虑这个初始步骤,并且应根据进行剩余 IHC 的方式来确定最佳固定方法。

包埋

固定后,需要将组织固定在一块中,以便将其切割成薄片进行染色。根据所选的固定方法,样本块的类型会因石蜡(用于使用薄片切片机切割)、温度敏感性和水溶性(用于使用低温切片机切割)或琼脂(用于在振动切片机上切割)而异。

组织切片

一旦组织可进行稳定切割,可使用不同的仪器切割成各种厚度的切片,具体取决于所需的 IHC 应用。尽管存在很多差异,但对于所有这些切割仪器来说,有一个共同的特点:使用非常锋利的刀片将组织切成片,而不会留下任何损坏。所选的刀片类型应与使用的仪器和要切割的组织匹配;使用期间应彻底清洁,以保持其锐度。切成组织切片时,将其放在玻片上,风干后再进行接下来的步骤。

抗原修复

有几种方法可用来显示在固定过程中被隐藏的表位。这些方法包括依赖于蛋白酶 K 等酶的蛋白水解诱导抗原修复法,或者利用热来解开交联键和分解蛋白的热诱导表位修复法 (HIER)。其中任意一种方法都能显示表位,使它更容易结合一抗,更顺利地进行 IHC(免疫组织化学)染色。

在 CST,我们最常用的抗原修复方法是 HIER,因此这就是我们将要详细探讨的方法。HIER 涉及对组织切片进行加热和冷却,同时要将它们浸没在有明确缓冲能力的溶液中。缓冲液的 pH 值 有助于在温度恢复至正常水平后保持蛋白解旋,因此系统 pH 值范围应根据目的抗体-表位相互作用进行优化。微酸性缓冲液柠檬酸 (pH 6.0) 能有效修复各种表位,但有些表位可能需要偏碱性的缓冲液,如 EDTA (pH 8.0)。

免疫染色

免疫染色原理与蛋白印迹实验的原理非常相似,但不纯化或将蛋白固定在膜上,而是要将蛋白固定在细胞内天然聚集的地方(即原位)。免疫染色过程可分为四个主要部分:1) 封闭和透化(如需要),2) 添加一抗,3) 选择和添加二抗,以及 4) 检测。免疫染色实验步骤的所有这四个部分相互协调,以为一抗高度特异性地结合单个蛋白以及正常观察该蛋白创造理想条件。因此,在制备和应用试剂时,应考虑若干重要的考虑事项(如下所示),并且您应该准备进行某些优化和疑难排解,以尽量增强信号,减少不必要的背景噪声。请牢记,除固定和组织制备外,由于 IHC 可用于进行两大类检测,免疫染色流程将主要由所需的读数决定:1) 显色,和 2) 荧光。最后,不同类别的一抗可用于直接和间接标记蛋白,抗原表达水平及其可及性可决定是否使用任何一种类型的抗体。

完成所有免疫染色后,可对各种细胞组分或大分子进行额外染色。这称为复染。复染标记亚细胞细胞器以及细胞的结构元素,而且可用于目的蛋白的情境研究。

封片和观察

完成所有染色后,组织现在差不多已准备好可使用显微镜进行观察。为此,需要使用封片试剂和盖玻片将组织装至显微镜玻片上。封片试剂可以是水性或永久性的,并且通常添加来保持染色,针对用于进行观察的显微镜的类型创建理想的折射率。最后一步是用盖玻片密封玻片,以保护组织并在某些情况下,保存玻片以便将来用于显影。

如何制备组织?

为了获得最佳读数,正确的样品制备至关重要。组织的采集和固定将直接影响样品完整性和组织内的大分子完整性,这反过来会影响靶蛋白的抗原性。所以,组织采集方法、固定试剂以及切片选择都取决于所需终点。

Phospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) (D1B5) Rabbit mAb #2842

使用 CST 推荐的修复缓冲液可改善您的最终染色结果。 在使用柠檬酸盐缓冲液(左图)或 EDTA 缓冲液(右图)进行抗原修复后,使用 Phospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) (D1B5) 兔单克隆抗体 #2842 对石蜡包埋的人肺癌细胞进行 IHC 分析。如图所示,使用 EDTA 缓冲液和 #2842 会使信号更强,并且在细胞膜上观察到染色增强。请查阅产品说明书,为您正在使用的抗体找到合适的修复缓冲液。

Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® 兔单克隆抗体 #9145

抗原修复建议使用微波炉。 在使用水浴(左图)、微波炉(中间)或高压锅(右图)进行抗原修复后,使用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® 兔单克隆抗体 #9145 对石蜡包埋的人肺癌细胞进行 IHC 分析。实验中,可见使用微波炉和水浴锅修复结果的显著不同。对于一些抗体而言,使用高压锅得到的信号比使用微波炉得到的信号强度大。

EGF Receptor (D38B1) XP® 兔单克隆抗体 #4267

靶向相同蛋白的抗体可能有不同的抗原修复首选方法。 通过在柠檬酸盐缓冲液(左)、EDTA 缓冲液(中)中煮沸,或经胃蛋白酶(右)裂解进行抗原修复后,利用 EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb #4267 和一种 EGFR 小鼠单克隆抗体对石蜡包埋人肺癌进行 IHC 分析。对于 #4267,经 EDTA 修复后获得了更强的信号。然而,对于竞争者的 EGFR mouse mAb, 只有经胃蛋白酶裂解后才可获得信号。

组织收集

固定

交联固定剂是组织学样品制备中最常用的固定剂,且通常为醛类。这些包括甲醛、多聚甲醛和戊二醛。如果醛固定不适合抗原检测或所需的读数,则可用其他类型的化学固定剂,例如氧化剂和酒精固定剂。例如,一般来说,相比用低分辨率显微镜观察的组织,用于通过电子显微镜观察的组织固定得更加稳固。另外,对于某些应用,物理固定方法,例如通过加热或冻干所实现的方法,可能更为适当。

组织包埋和处理

固定在甲醛/福尔马林中的组织样品通常包埋在石蜡中,这是一种基于蜡的包埋剂。这类组织通常称为福尔马林固定石蜡包埋的 (FFPE) 组织。FFPE 组织通常用切片机切成薄切片,可装在包被玻片上。虽然这类固定和包埋是最常见的,且可实现长期组织存放和细胞结构的卓越维护,但切割后和免疫染色前需要几个步骤,才能发现靶蛋白并允许抗体结合。这些步骤包括烤干、风干或微波干燥、使用有机溶剂脱蜡以及抗原修复—所有的均在免疫染色之前进行。尤其是,抗原修复对暴露抗原至关重要,在 pH 值不同的不同缓冲液中煮沸样品或使用蛋白水解酶消化组织可实现。

如果组织或抗原不适合福尔马林固定,则可用多聚甲醛 (PFA) 固定样品或将其包埋在温度敏感的低温材料中,并用液氮速冻。在这两种情况下,可使用冷却薄片切片机或低温切片机将冷冻组织切割成可装在玻片上的薄切片。制备和使用这种组织比 FFPE 组织更容易,但形态并不能很好地保存。请记住,冷冻组织还需要在冷冻之前通过渗透作用去除水分子,以减少冷冻假象。将切片放在玻片上后,通常会对非固定组织进行固定后的步骤。将低温切片机切割的切片放在玻片上后,可能需要进行很短时间的干燥。与 FFPE 组织相似,冷冻切片组织也可能需要抗原修复步骤,具体取决于目标抗原的可及性。

或者,可直接使用振动薄片切片机或振动切片机切割固定组织,本身无需包埋。组织可以可逆地包裹在琼脂中,让其稳定,从而刚好可使用振动切片机进行切割。所得自由浮动切片可以存储在生理缓冲溶液中,并在孔中染色。这些切片一般过厚,因此,抗体可能无法最大程度地渗透。但很好地维护了组织完整性,同时使得试剂使用量最少。自由浮动切片需要在免疫染色后装片。在这种情况下,不需要干燥组织切片。

如何进行免疫染色

免疫染色是一个使用抗体检测细胞或组织样品中某种特异性蛋白的任何方法的通用术语。在计划您的免疫染色实验时,有几个方面将取决于您正在进行的特定免疫染色类型的实验步骤。以下资源有助于设计和进行采用 FFPE 组织的最佳 IHC 实验。

 

免疫组织化学实验技巧和技术

 

更好的 IHC 简介和步骤 1:抗原修复

 

更好的 IHC 步骤 2:抗体稀释

 

更好的 IHC 步骤 3:检测

 

更好的 IHC 步骤 4:色原

Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® 兔单克隆抗体 #4060 或 Phospho-EGF Receptor (Tyr1173) (53A5) 兔单克隆抗体 #4407

为获得最佳结果,应如产品数据表所述始终使用推荐的一抗稀释剂。 在用 SignalStain® Antibody Diluent (左图)或 TBST/5% NGS(右图)稀释后,利用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060Phospho-EGF Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb #4407 对石蜡包埋人乳腺癌(上图)和 HCC827 异种移植物(下图)进行的 IHC 分析。如图所示,与用 TBST/5% NGS 稀释相比,#4060 经 SignalStain®Antibody Diluent 稀释所得信号强度更强 。相比之下,#4407 在用 TBST/5% NGS 稀释时的效果更好。请查阅产品数据表中针对所选特异性抗体的推荐稀释剂。

如何选择用于 IHC 的优质抗体

并非所有抗体都适用于免疫组织化学实验。仅仅因为一个抗体在蛋白印迹实验中显示出较强的特异性条带,并不意味着它在一个 IHC 检测中就具有特异性或甚至有用的。这是由于抗原呈递存在差异。首先,看看供应商如何在内部对抗体进行 IHC 验证。据 Rimm 等人所述,在高、中和低表达的细胞系或组织中,应有理想可信服的数据。此外,应使用多种实验模型验证抗体在细胞沉淀物、组织阵列等中的性能,以确定在各种样品中的特异性和功能性。另外,IHC 的抗体性能高度依赖于透化、抗原修复以及检测过程中使用的实验步骤和试剂。供应商应清楚地记录这些内容。这还有助于查看支持在 IHC 中使用抗体的出版物。比起出版物的质量、所使用的方法和稀释描述,引用数量通常没那么重要。如果未找到支持性的已出版材料,在调整方法来满足您自身需求之前,一般最好先复制用于验证供应商提供的抗体性能的方法。请记住,在开始您的实验之前,所有抗体都应在您正在使用的应用中进行验证。

有关物种的注意事项

在确定经过良好验证的抗体之后,其他几条信息将有助于确定该抗体是否适合您。一个重要因素是产生抗体的物种。一抗的物种将决定使用哪种二抗。这是因为二抗必须以一种能检测一抗物种的方式进行设计。这意味着,在理想情况下,一抗的物种应与您的细胞或组织样品的物种不同,因为如果这两种是相同的物种,您的二抗很可能会在切片内结合内源性 IgG!

物种反应性如何影响抗体选择?

一抗应能检测靶蛋白中物种特异性的氨基酸序列或表位(即小鼠蛋白与人蛋白)。因此,如果对含有精确氨基酸序列的蛋白使用,您的抗体效果会最佳。例如,如果组织样品为人源,则最好确保已证实您的目标一抗与人样品会发生反应。有时表位在物种中较保守,有时候,它们有很大差异—所以请明智地选择!

同种型会如何影响二抗选择?

此时,您已经准备好最终选择一抗和二抗组合。别忘了,无论您的一抗是单克隆还是多克隆抗体,其特异性同种型可能会根据产生这种抗体的物种有所不同。您的二抗需要匹配这种同种型;即,一个 IgG 一抗同种型应与一个抗 IgG H&L(重链和轻链)二抗匹配。存在多种同种型,因此可以多次使用多种抗体,不会有交叉反应性。我们将在以下的“多重实验”部分详细讨论。

封闭步骤

使用精选的一抗孵育您的样品前,您需要封闭您的样品。这个步骤的重点是防止您的抗体与组织内的其他蛋白发生非特异性结合。

什么是封闭?

封闭依赖于使用一种含各种蛋白的稀释溶液,有效地用多余蛋白包被您的样品,这些蛋白可吸引溶液中的任何未结合的一抗或二抗,并防止抗体与组织切片发生非特异性结合。虽然封闭是一个相对简单的步骤,但请注意,有些蛋白比其他蛋白更适合根据应用提供适当的封闭效果。重要的是,蛋白溶液不会意外结合靶蛋白的表位,也不会降低其可检测性。牛血清白蛋白 (BSA) 和不同动物的血清经常用于封闭。将血清用作封闭试剂时,确保让源动物与二抗物种匹配。这将最大程度地减少二抗与组织内的随机蛋白出现结合。

为什么要进行封闭步骤?

因为这是您必须进行的!但实际上,封闭仅有助于限制您的一抗和二抗与您的样品出现所有非特异性结合。记住,特异性结合是您成功进行免疫染色所需要的,因此,正确进行这一步对得到最佳染色效果大有作用!

检测方法

完成靶蛋白免疫标记后,才可能观察信号。有多种检测方法可以用来观察免疫标记蛋白,而方法的选择取决于免疫染色步骤中使用的抗体类型。这些方法包括两大组:1) 显色法检测,和 2) 荧光检测。在开始 IHC 实验之前,应确定所需的检测方法,以便选择合适的一抗和(更重要的是)二抗。

显色法检测方法有多种优势:1) 灵敏度更高(信号扩增更强),和 2) 信号更持久。或者,基于荧光的检测方法还有若干优势:1) 多重实验更简单、更高级(因为有一系列具有不同荧光光谱的荧光团),2) 动态范围更宽,3) 共定位蛋白可视化,和 4) 实验步骤更简单、更具时效,因为无需化学底物。IHC 方法可以是直接或间接的,其中产生信号的半偶族偶联一抗(直接)或二抗(间接)。

荧光检测与显色法检测

使用 PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684(左)、B7-H4 (D1M8I) XP® Rabbit mAb #14572(中)和 Pan Keratin (C11) Mouse mAb #4545 对卵巢癌连续切片进行免疫组织化学染色,分别使用荧光检测系统和显色法检测系统评价这两种免疫检查点蛋白质的表达模式和水平。注:拍摄的图像为不同观察视野。

Sox2 (D6D9) XP® 兔单克隆抗体 #3579

基于聚合物的检测比基于生物素系统更敏感。 利用 Sox2 (D6D9) XP® Rabbit mAb #3579 和采用基于生物素的检测(左图)或基于聚合物的检测(SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8114;右图)对石蜡包埋的人肺癌进行的 IHC 分析。如图所示,基于聚合物的检测敏感度更高,染色强度更好。

Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® 兔单克隆抗体 #9145

并非所有 DAB 底物均可达到同等的效果 。利用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145 对石蜡包埋的人乳腺癌进行的 IHC 分析 。使用 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059(左图)、竞争者 1 提供的 DAB(中间)或竞争者 2 提供的 DAB(右图)进行显色法检测。尽管竞争者 2 DAB 产生的信号与SignalStain® DAB Substrate Kit 的信号相当,但竞争者 1 的 DAB 产生的信号明显较弱。

复染

除了对所需蛋白进行免疫标记外,还可使用复染来观察特定细胞结构。通常这些染料会靶向细胞体、胞核和其他亚细胞器。结合使用蛋白标记和复染可以让您将蛋白定位至细胞的特定区室,在尝试确定免疫染色是否准确检测您的目的蛋白或是否因病理学过程而错误定位该蛋白时,这可能很有用。

常用的复染剂:

复染 靶标 颜色
Hematoxylin 胞核 蓝色
甲基绿 胞核 绿色
核固红 胞核 粉色

结果检查

最后,是时候看看您辛勤工作的结果了!对于显色检测,需要用光学显微镜观察显色酶产生的彩色标记。另一方面,荧光检测需要使用荧光显微镜适当地激发荧光团并捕获发射光。对于两种观察方法,最好先观察样品是否具有目的蛋白的已知表达以及无任何信号的阴性对照。这样做,可以建立合适的环境,以便观察目的蛋白和最小化背景信号。在理想情况下,对于定量分析,单个实验中的所有样品都应在相同环境下染色和成像。显色或荧光信号的强度可以在图像分析软件(例如 Imagej)中进行分析,以便定量信号。阳性和阴性对照,以及优化和标准化将确保获得的结果准确无误。

Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® 兔单克隆抗体 #4370

恰当的对照是确保特异性信号的必要的环节。 Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb #4370 与竞争者的 IHC 认证的 phospho-p44/42 (Tyr202/Tyr204) 抗体进行对比。分别评估各抗体的最佳稀释比例,以使抑制剂 U0126 (左图)处理的 NIH/3T3 细胞(A)中的非特异性染色度最低,使经激活剂 TPA #4174(右图)处理的 NIH/3T3 细胞中的特异性信号强度最高。在石蜡包埋人卵巢癌(B)的 IHC 分析中使用为各抗体确定的最佳稀释比例。注意:在所推荐的稀释比例下,竞争者的抗体对经抑制剂处理的细胞 (NIH/3T3 + U0126) 进行了染色 。在 CST 确定的最佳稀释比例下,竞争者的抗体不仅没有对经抑制剂处理的细胞进行染色,而且也未明显对组织进行染色。CST 抗体精确地对细胞和组织进行了染色。

如何通过多重实验查看多个目标

多重实验可一次性观察给定样品中的多个蛋白靶标,对于有限数量的珍贵样品而言,以及在对蛋白相互作用或共定位感兴趣的情况下尤其有利。但在多重 IHC 实验中,需要更高程度的优化。关键是选择不同物种或同种型的一抗,以最大限度地减少二抗的交叉反应性。另外,荧光偶联的二抗需要具有非重叠光谱的不同荧光团,并且酶连接的二抗需要非重叠酶-底物相互作用和染料。要验证一抗和二抗是否如预期一样相互结合,则应包括几个对照组:无抗体对照、仅一抗对照、仅二抗对照,以及每个一抗与所有二抗,以确保无交叉反应性。有关荧光多重方法的更多信息,请单击此处

FFPE 扁桃体。

FFPE 扁桃体上的 PD-L2(橙色)、PD-L1 (E1L3N®)(红色)、CD68(绿色)、PD-1(黄色)、CD8α(品红色)和 Pan-Keratin(蓝绿色)。

mIHC 多重选择

多重选择

使用酪胺进行荧光 mIHC:概述

结论

IHC 是一种适合许多应用的通用性极强的技术。与其他方法一样,认真控制和正确优化实验步骤将得到最佳结果。其在诊断、生物医学研究 IHC 中的应用就能回答低到高通量领域的许多科学问题。

其他资源

应用说明:
使用多重 IHC 检测免疫检查点蛋白和 T 细胞耗竭

应用说明:
使用多重 IHC 检测免疫抑制性肿瘤微环境

海报:
Highly Multiplexed IHC Assays to Examine Immune Checkpoints and Biomarkers for Immunotherapy

海报:
Multiplex IHC Detection of Immune Checkpoint Receptors in the Tumor Microenvironment

网络讲座:
Highly Multiplexed IHC Assays to Examine Immune Checkpoints and Biomarkers for Immunotherapy

网络讲座:
多重 IHC 和新单克隆抗体用于肿瘤免疫学研究

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