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甲醇通透的免疫荧光实验步骤‭(免疫荧光甲醇通透)

重要事项:请参阅产品数据表首页或产品网页的应用板块,以确定该产品是否适用于培养的细胞系 (IF-IC)、石蜡包埋样品 (IF-P) 或冰冻组织切片 (IF-F)。

A. 溶液和试剂

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  • 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS) (#9808): 配制 1 L 的 1X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。:调节 pH 至 8.0。
  • 甲醛, 16%, 无甲醇,Polysciences 公司出品。(货号18814 ),使用新鲜制剂,小瓶打开后避光 4°C 保存,PBS 中稀释后使用。按照 1 比 4 的比例在 1X PBS 中稀释,制成 4% 甲醛溶液。
  • 甲醇,100%
  • 封闭缓冲液(1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100):
    准备 10 ml 溶液,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如加入 Normal Goat Serum (#5425) 到 9.5 ml 1X PBS 中)并混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  • 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100):
    准备 10 ml 溶液,添加 30 µl Triton X-100 到 10 ml 1X PBS 中。混匀后再加入 0.1g BSA (#9998),并混匀。
  • 荧光物质标记二抗:
    (抗小鼠 #4408, #4409, #8890, #4410) (抗兔 #4412, #4413, #8889, #4414)(抗大鼠 #4416, #4417, #4418)。
  • Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本准备

I. 培养细胞系 (IF-IC)

:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
    :甲醛有毒性,仅限在通风橱中使用。
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液,用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

II. 冰冻/低温切片 (IF-F)

  1. 冰冻固定组织进行免疫染色(C 部分)。
  2. 对新鲜未固定的冰冻组织,请立刻按下列步骤固定:
    1. 将切片覆盖一层用 PBS 稀释的 4% 甲醛溶液。
      :甲醛有毒性,仅限在通风橱中使用。
    2. 室温下固定切片 15 分钟。
    3. 用 PBS 漂洗玻片三次,每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 甲醇通透化步骤: 在细胞或组织切片上覆盖冰冷的 100% 甲醇(使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm,不要让其干燥),并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟,后用 PBS 漂洗 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
    :如果使用荧光物质标记的一抗,则跳转到 C部分,第 8 步。
  7. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  8. 按照步骤 6,使用 PBS 漂洗。
  9. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  10. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2016 年 7 月

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