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使用 Image-iT™ FX Signal Enhancer 的免疫荧光实验步骤

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  • 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):
    要制备 1 L,添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4​g 磷酸一钾 (KH2PO4) 到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 8.0。
  • 甲醛(16%,不含甲醇,Polysciences, Inc.,货号 18814),使用新鲜制剂,打开的小瓶避光保存在 4°C 下,用 PBS 稀释后使用。
  • 通透缓冲液 (1X PBS/0.2% Triton X-100):
    要制备 25 ml,添加 2.5 ml 10X PBS 和 22.5 ml dH2O,混匀。搅拌时加入 50 µl Triton X-100。
  • Image-iT™ FX Signal Enhancer (#11932)
  • 封闭缓冲液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton X-100):
    要制备 25 ml,添加 2.5 ml 10X PBS、1.25 ml normal goat serum 和 21.25 ml dH2O,混匀。搅拌时加入 75 µl Triton X-100。
  • 抗体稀释缓冲液 (1X PBS/1% BSA/0.3% Triton X-100):
    要制备 40 ml 溶液,将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH2O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。搅拌时加入 120 µl Triton X-100。
  • Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

:细胞应直接在多孔平板、腔室玻片或在盖玻片上生长、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
    :甲醛有毒性,仅限在通风橱中使用。
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液,用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在通透缓冲液中室温通透处理细胞 5 分钟。
  2. 用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  3. 滴 3-4 滴 Image-iT™ FX Signal Enhancer (#11932),并在室温下孵育 30 分钟。
  4. 用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  5. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  6. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  7. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  8. 4°C 温度下孵育过夜
  9. 用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  10. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071), with DAPI (#8961) 对玻片封盖。
  11. 为达到最佳效果,应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布于 2011 年 2 月

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