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使用 DOTMAC 通透方法的免疫荧光实验步骤

重要事项:请参考数据表首页的应用部分,以确定该产品是否已经验证并获批用于本实验步骤。

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  • 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):为了配制 1 L,添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。调节 pH 至 8.0。
  • 甲醛(16%,不含甲醇,Polysciences, Inc.,货号 18814),使用新鲜制剂,打开的小瓶避光保存在 4°C 下,用 PBS 稀释后使用。
  • 十二烷基三甲基氯化铵 (DOTMAC),>97.0%,TCI America(货号:D1016),用 PBS 重新配制再使用。
  • 封闭缓冲液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425)):
    要制备 25 ml,添加 2.5 ml 10X PBS、1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(如常规山羊血清、常规驴血清) 和 21.25 ml dH2O,混匀。
  • 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA):
    要制备 40 ml 溶液,将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH2O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。
  • 荧光物质偶联的二抗建议使用的二抗
    :首次使用一抗或荧光素标记二抗时,将抗体滴定至最佳稀释比例,使样品在最少的背景干扰下,获得最强的特异性信号。
  • Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 随后吸干液体,在细胞上覆盖一层 2–3mm 深的用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
    :甲醛有毒性,仅限在通风橱中使用。
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液,用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. DOTMAC 通透步骤:在细胞上覆盖用 PBS 稀释的 0.05% DOTMAC。在室温下孵育 15 分钟,用 PBS 漂洗三次,持续 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
    :如果使用直接偶联 Alexa Fluor® 荧光物质的一抗,则跳到步骤 C10。
  7. 在用抗体稀释缓冲液稀释的荧光素偶联的二抗中,室温孵育样品 1-2 小时,避光。
  8. 按照步骤 7,使用 PBS 漂洗。
  9. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071), with DAPI (#8961) 对玻片封盖。
  10. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

*推荐的二抗:

兔抗

鼠抗

抗大鼠

发布​于 2010 年 6 月 

修订于 2010 年 12 月

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