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针对生物素偶联抗体的免疫荧光实验步骤

重要事项:请参阅产品数据表首页或产品网页的应用板块,以确定该产品是否适用于培养的细胞系 (IF-IC)、石蜡包埋样品 (IF-P) 或冰冻组织切片 (IF-F)。

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  • 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):为了配制 1 L,添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。调节 pH 至 8.0。
  • 甲醛(16%,不含甲醇,Polysciences, Inc.,货号 18814),使用新鲜制剂,打开的小瓶避光保存在 4°C 下,用 PBS 稀释后使用。
  • 封闭缓冲液 (1X PBS / 5% 常规山羊血清 (#5425) / 0.3% Triton X-100):
    要制备 25 ml,添加 2.5 ml 10X PBS、1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(如常规山羊血清、常规驴血清) 和 21.25 ml dH2O,混匀。搅拌时加入 75 µl Triton X-100。
  • 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):
    要制备 40 ml 溶液,将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH2O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。搅拌时加入 120 µl Triton X-100。
  • 荧光物质偶联的亲和素/链霉亲和素
    :首次使用任何一抗或荧光物质偶联的亲和素/链霉亲和素时,我们建议进行一次完整的滴定,以确定哪种稀释度会在最低的背景下对您的样品产生最强的特殊信号。
  • Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), with DAPI (#8961)。

IF-P 应用专属试剂:

  • 二甲苯
  • 无水变性的乙醇,组织级为 100% 和 95%
  • 抗原修复:
    • 柠檬酸: 10 mM 柠檬酸钠缓冲液:要制备 1 L,添加 2.94 g 柠檬酸钠三钠盐二水化物 (C6H5Na3O7•2H2O) 到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 6.0。
    • EDTA: 1 mM EDTA:要制备 1 L,添加 0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 到 1 L dH2O 中。调节 pH 至 8.0。

B. 标本准备

I. 培养细胞系 (IF-IC)

:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 用 PBS 稍微漂洗细胞。
  2. 吸干 PBS,在细胞上覆盖一层 2–3mm 深的用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
    :甲醛有毒性,仅限在通风橱中使用。
  3. 室温下固定细胞 15 分钟。
  4. 吸干固定液,用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行免疫染色 C 部分。

II. 石蜡切片 (IF-P)

:在这个过程中,任何时候都不要让玻片变干。

  1. 脱蜡/复水:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    4. 切片用 dH2O 漂洗两次,每次 5 分钟。
  2. 抗原修复:
    :请查阅产品数据表,了解有关修复液的具体建议。
    1. 对于柠檬酸: 将玻片放入 10 mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 中煮沸,随后在亚沸温度下煮 10 分钟。在实验台上冷却玻片 30 分钟。
    2. 对于 EDTA: 将玻片放入 1 mM EDTA (pH 8.0) 中煮沸,随后在亚沸温度下煮 15 分钟。无需冷却。
  3. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

III. 冰冻/低温切片 (IF-F)

  1. 冰冻固定组织进行免疫染色(C 部分)。
  2. 对新鲜未固定的冰冻组织,请立刻按下列步骤固定:
    1. 在切片上覆盖用 PBS 稀释的 2-4% 甲醛。
      :甲醛有毒性,仅限在通风橱中使用。
    2. 室温下固定切片 15 分钟。
    3. 用 PBS 漂洗玻片三次,每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

:对于内源性生物素水平较高的组织或细胞,需要使用生物素封闭试剂盒(即 Endogenous Biotin-Blocking Kit,Invitrogen 货号 Cat.#E21390)E21390),随后再执行这一节中的步骤 1。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 温度下孵育过夜
  5. 用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 在用抗体稀释缓冲液稀释的荧光物质偶联亲和素/链霉亲和素中,避光室温孵育样本 30 分钟。
  7. 用 PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071), with DAPI (#8961) 对玻片封盖。
  9. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2009 年 1 月 

修订于 2011 年 8 月

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