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免疫荧光 (IF) 疑难排解指南

信号微弱或没有信号

可能原因

建议

样品保存不当;如果荧光团暴露于光线下的时间过长,可能会导致信号衰减。

在避光条件下进行孵育和样品储存。可将样品封装于 ProLong® Gold 抗淬灭试剂 #9071 等抗光褪色溶液中。封装后要立即对样品进行成像,以获取最佳结果。

细胞/组织样品的储存时间过长

使用新鲜制备的载破片/板,以避免丧失抗原性。

固定不充分

请查阅 CST 产品数据表以了解建议的实验步骤;处理后立即去除培养基并用固定剂快速/彻底清洗。对于磷酸化特异性抗体,使用浓度至少为 4% 的甲醛来抑制内源性磷酸酶。

抗体稀释度不正确(抗体过度稀释)

请查阅 CST 产品数据表或 cellsignal.com 以了解建议的抗体稀释度。

未使用建议的孵育时间

按照经严格检测的实验步骤进行一抗孵育,才能获得一致、可靠的结果。经开发和验证的 CST 抗体在 4°C 下过夜孵育时可获得最佳结果。

测试模型不恰当

在可能的情况下,应使用蛋白质印迹法或其它方式来确认蛋白表达。

未正确诱导靶蛋白

应针对每种靶标确定最佳处理条件和对照。

目的蛋白表达较低

修改检测方法;考虑放大信号,或与更亮的荧光团配对。

通透方法错误

请查阅数据表以了解建议的实验步骤。

二抗使用不正确

按建议浓度使用,并检查二抗是否与一抗的宿主相匹配。

激发波长错误

确保照射和检测(激光/激发/发射滤光片)与一个或多个荧光团的激发波长相匹配。

多重 IHC 中信号较弱

优化脱蜡、抗原修复和信号放大方法。

高背景

可能原因

建议

样品自发荧光

以未经染色的样品为对照,检测自发荧光程度。请查看数据表以了解正确的固定试剂。陈旧的固定剂可能会产生自发荧光;更换陈旧甲醛存货并制备新鲜的稀释物。使用在安瓿中新鲜稀释的 EM 级戊二醛。对于低丰度靶标,选择较长的波长通道。

封闭不充分

使用与二抗同一物种来源的正常血清。考虑使用基于电荷的封闭剂,例如 Image-iT® FX 信号增强剂 #11932,具体视背景来源而定。

抗体稀释度不正确(一抗或二抗浓度过高)

请查阅 CST 产品数据表或 cellsignal.com 以了解建议的抗体稀释度。

样品变干

在整个染色过程中始终保持样品处于液体中,这一点非常关键。

清洗不充分

清洗以去除多余固定剂、多余二抗,以及游离结合、非特异性抗体相互作用。

二抗交叉反应性

使用同型对照抗体,以确定你的二抗是否发生交叉反应。

非特异性抗体结合

如可能,请与敲低 (siRNA) 或敲除细胞进行比较,或与已知表达靶抗原的水平较高或较低的细胞进行比较。

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