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固定免疫沉淀实验步骤/(用于通过蛋白质免疫印迹实验进行分析)

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)
  2. 1X 细胞裂解缓冲液: (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na3VO4、1 µg/ml 亮抑酶肽

:CST 建议在使用前添加 1 mM PMSF*。

  1. 3X SDS 样品缓冲液: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl(pH 值6.8 ,25°C 条件),6% w/v SDS,30% 甘油,150 mM DTT,0.03% w/v 溴酚蓝

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10cm) 添加 0.5ml 1X 冰冷的细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF*,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上对样品超声处理四次,每次 5 秒钟。
  6. 在 4°C 下微量离心 10 分钟,然后将上清液转移到一根新的试管中。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

  1. 取 200 μl 细胞裂解物,并添加 10 µl 固定抗体,在 4°C 下孵育过夜,轻轻摇动。
  2. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  3. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液使沉淀物重新悬浮。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  4. 将样品加热到 95–100°C 并持续 2–5 分钟。
  5. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE 凝胶 (12–15%) 上。
  6. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)

发布​于 2007 年 12 月 

修订于 2018 年 11 月

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