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荧光蛋白质免疫印迹实验步骤(在 BSA 中孵育一抗)

对于蛋白质印迹实验,在 4°C 下,将膜与稀释的抗体放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween-20 中孵育,轻轻搅动,过夜。

:双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和标记有不同染料的二抗。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液,则在两种缓冲液中分别对每种一抗进行检验,以确定最适合进行双重标记实验的缓冲液。

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A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): ( #9808) 要配制 1L 1 X PBS:添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml dH2O 中,混合均匀。
  2. 1X SDS 样品缓冲液:#7722#7723):62.5 mM Tris-HCl(在 25°C 下 pH 为 6.8)、2% w/v SDS、10% 甘油、50 mM DTT、0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
  3. 转移缓冲液: 25 mM Tris 碱、0.2 M 甘油、20% 甲醇 (pH 8.5)。
  4. 10X Tris Buffered Saline (TBS): ( #9997) 要配制 1L 10X TBS:24.2 g Tris 碱、80 g NaCl;用 HCl(使用 1X)将 pH 调节至 7.6。
  5. 脱脂乳粉: (#9999)(重量/体积 [w/v])。
  6. 封闭缓冲液:1X TBS、5% w/v 脱脂奶粉;要配制 150 ml,添加 15 ml 10X TBS 到 135 ml dH2O 中,混匀。添加 7.5 g 脱脂乳粉,混匀。
  7. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBS、0.1% Tween-20 (TBS/T)。
  8. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  9. 一抗稀释缓冲液: 1X TBS、0.1% Tween-20、5% BSA;要制备 20 ml,添加 2 ml 10X TBS 到 18 ml 水中,混匀。加入 1.0 g BSA 并混匀。搅动时,加入 20 µl Tween-20 (100%)。
  10. 二抗稀释缓冲液: 1X TBS、0.1% Tween-20、5% 脱脂奶粉;要配制 20 ml,添加 2 ml 10X TBS 到 18 ml 水中,混匀。添加 1.0 g 脱脂乳粉,混匀。搅动时,加入 20 µl Tween-20 (100%)。
  11. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format): (#7720)。
  12. 印迹膜: 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化(推荐)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;使用冷的 1X PBS 洗涤细胞;吸取。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒,完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 将 20 µl 样品加热至 95-100°C,时长 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 用微量离心机分离 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

:建议将预染蛋白分子量标准品(#7720,10 µl/泳道)上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

  1. 电转移至硝酸纤维素膜。

C. 膜封闭和抗体孵育

:容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,请相应调整容量。

  1. (可选)转移后,在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。
  2. 膜在室温下用 25 ml 封闭缓冲液孵育 1 小时。
  3. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  4. 将膜和一抗(按照产品数据表中建议的适当稀释度)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  5. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  6. 将膜与荧光素偶联的二抗(1 mg/ml 母液按 1:5000-1:25,000 稀释)放在 10 ml 二抗孵育缓冲液中室温孵育 1 小时,轻轻搅动。
  7. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。

D. 蛋白质检测

  1. 将膜上多余的 TBS/T 沥干,并让它干燥。
  2. 请使用合适的荧光扫描仪并根据制造商的建议扫描膜。

发布​于 2008 年 5 月 

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