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流式细胞术疑难排解指南

问题 可能的原因 建议
问题 可能的原因 建议

使用流式细胞分析仪检测到的荧光信号较弱,或没有荧光信号。

处理未充分诱导靶标表达。

要对每个靶标进行成功和可测量的诱导,请优化处理条件。

如果使用 PBMC,则请避开冰冻样品。在可能的情况下,分离新鲜细胞。

包括合适的对照:

  • 未刺激/未处理的对照
  • 同型对照
  • 单独细胞(未染色)对照
  • 阳性对照

样品固定和/或通透不充分。

如果目的靶标为胞内靶标,则请确保使用合适的固定和通透实验步骤。根据靶标以及是否同时进行表面标记物染色,可能需要不同形式的固定和通透处理。甲醛固定法可连同皂苷、Triton X-100 或 90% 甲醇(冰冷)一起使用,以便进行通透处理。70% 乙醇(冰冷)有时可用作一种备选的固定方法,尤其是在进行细胞周期分析时。

注意,有时固定会妨碍某些表面表位的检测。因此,在继续进行双重胞外和胞内染色之前,建议检测胞外目的表位对考虑使用的固定剂的反应如何。

固定剂应在处理后立即添加,并且其浓度应足以抑制任何磷酸酶活性(CST 建议使用 4% 的甲醛)。

确保使用不含甲醇的甲醛来防止胞内蛋白丢失,因为在取得充分交联之前,细胞通透处理可能会导致胞内蛋白丢失。

对于甲醇通透处理,在逐步滴入冰冷的甲醇之前,将细胞放在冰上冰冻以防止低渗休克,这点非常关键。

弱表达的靶标与暗淡的荧光物质配对。

始终使用最亮的荧光物质(如 PE)偶联物来检测最低密度的靶标(如 CD25),并使用最暗的荧光物质(如 FITC)偶联物来检测最高密度的靶标(如 CD8)。

注意,在用于胞内染色时,某些荧光物质比其他物质更经得起检验。要考虑的因素为荧光物质的大小、构象和稳定性。例如,对于胞内染色(尤其是胞核染色),分子量较大的荧光物质(如某些合成染料)更为不利,因为它们难以高效穿透细胞和核膜。

如果使用二抗检测,那么二抗的特异性可能不正确(例如,使用 抗鼠 IgG PE 偶联二抗 检测兔 IgG 一抗的结果不正确)。

确保按建议的浓度添加二抗,并且针对一抗的正确宿主。

流式细胞分析仪上的激光和 PMT 设置可能不适合偶联一抗或二抗的荧光物质。

确保激光波长和 PMT 设置匹配所用荧光物质的激发和发射波长。

细胞的散射特性未达最佳标准(如前向和侧向散射值较低)。

仪器设置不正确。

确保使用对照样品或使用前一次实验中的仪器设置,将正确的仪器设置加载到细胞分析仪中。

固定/通透的样品制备物欠佳。

请遵循 CST 的标准流式细胞术实验步骤(针对细胞)或流式细胞术备选实验步骤(针对人全血细胞)。按照说明完成使用 90% 甲醇的通透步骤非常重要,也就是说,将 90% 冰冷的甲醇逐步滴入您的细胞沉淀物中,同时轻轻涡旋以确保均匀通透,并避免因快速将细胞浸入低渗溶液(如甲醇)而致使细胞受损。

细胞分析仪上的流动细胞可能出现封堵。

按照制造商的说明疏通细胞分析仪(通常用 10% 漂白剂处理 5-10 分钟,随后用 dH2O 处理 5-10 分钟)。

在对样品检测细胞周期分布时,DNA 含量的柱状图没有分解细胞周期的不同阶段,即 G0/G1、S 和 G2/M 期。

流速不正确。

确保在您的细胞分析仪上使用最低的流速设置来检测样品。高流速会产生较高的变异系数 (CV),从而导致在细胞周期的不同阶段丢失分辨率。

使用碘化丙啶/ RNA 酶 (PI) 溶液进行的染色不充分。

在 PI/RNA 酶溶液 (#4087) 中直接重悬细胞沉淀物,并孵育至少 10 分钟;如果因荧光通道配置而无法使用 PI,则用备选的 DNA 染料,如 DRAQ5® (#4084) 或 DAPI (#4083)。

细胞不会增殖。

应在异步和指数生长期间收集细胞,以确保正确表示所有的细胞周期阶段。

阴性细胞群中的信号较强。

脱靶细胞群(如单核细胞)可能会表达 Fc 表面受体,这种受体结合一抗或二抗的 Fc 部分,从而导致非特异性染色。

染色前,尝试用牛血清白蛋白、Fc 受体封闭试剂或相同宿主的正常血清用作一抗和/或二抗来封闭细胞。

使用仅含二抗的对照来确定背景染色是否源于一抗或二抗。

在抗体孵育之间,进行额外的洗涤步骤。

使用流式细胞术备选实验步骤时,红细胞裂解不完全。

可能有必要进行额外洗涤来清除红细胞碎片。

如有必要,每个步骤之间最多增加 3 次洗涤。

0.1% Triton X-100 溶液可能不新鲜。

使用新鲜试剂,并严格遵循 CST 经广泛优化的流式细胞术实验步骤。

流式细胞术备选实验步骤源于出版物 [Chow et al., (2005) Cytometry Part A 67A:4–17],该出版物可用作进一步的资源。

抗体适合其他应用,但不适合流式细胞术。

不建议将该抗体用于产品数据表中的流式细胞。

该抗体未经检测或未通过 CST 对流式细胞术验证提出的标准。

对于获批仅用于免疫荧光实验的抗体,通过进行一系列滴定来测定最佳浓度,以进行流式细胞术。

联系技术支持,了解有关抗体检测状态/历史版本的进一步信息。

高背景。

抗体太多。

使用建议的抗体稀释度。CST 建议的稀释度已使用 105-106 个细胞进行了优化。使用较低的细胞数时,我们建议您自行进行滴定。

两步骤的抗体染色。

如果可能,避免使用生物素化抗体。在进行胞内染色时,由于使用链霉亲和素或抗生物素二抗偶联物检测胞内自然存在的内源性生物素,这些很容易导致较高的背景水平。

在可能的情况下,进行直接染色。

存在死细胞。

在进行活细胞表面染色时,使用活细胞鉴定染料(如 PI 或 7-AAD)对死细胞设置门控。但对固定细胞完成染色时,使用可固定的活细胞鉴定染料(如 eFluor®),这种染料能经受固定处理,可在胞内染色时结合使用。

自发荧光较强。

值得注意的是,某些细胞类型(如嗜中性粒细胞)本身会显示出比其他细胞更高的自发荧光水平。

可采取两种互相不排斥的方法来解决这个问题:

  1. 使用在红移型通道中发射光的荧光物质,在这个通道中,自发荧光最弱。例如,与 FITC 或 Pacific Blue 相比,APC 不太可能会产生自发荧光。
  2. 在显示自发荧光的通道中使用非常明亮的荧光物质。这意味着使用 Alexa Fluor 488 或 Brilliant Blue 515,而不是 FITC,使用 Brilliant Violet 421,而不是 Pacific Blue,最好进行生物素-链霉亲和素和一抗-二抗步骤来扩增信号。
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