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流式细胞术,Triton™ X-100 通透实验步骤

重要事项:请参阅产品网页上的产品专用流式细胞术实验步骤,以了解相应的固定和通透条件以及建议的抗体稀释比例。

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton™ X-100) #51995 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲盐水(PBS):配制 1 L 的 1X PBS:添加 100 ml 10X PBS (#12528) 至 900 ml 水,然后将其混合。
  2. 4% 甲醛,不含甲醇 (#47746)
  3. 细胞通透缓冲液:购买即用型 (#39487) 或者通过添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 抗体稀释缓冲液来制备10 ml。储存在 4°C。
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。
  5. 推荐的二抗:要检测未偶联的抗体,请选择与您的一抗(例如兔)的宿主物种匹配的二抗。点击此处以获取被批准用于流式细胞术的二抗的最新列表。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问我们的列表,了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定和通透

:固定前,应分离贴壁细胞或组织,使它成为单细胞悬浮液。

:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

:如果使用全血,则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。

:如果表位被甲醛和/或 Triton™ X-100 破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中,这类抗体保持结合目的靶标。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。
  5. 在每一百万个细胞约 100 μl 细胞通透缓冲液中重悬细胞。
  6. 在室温孵育 10 分钟。
  7. 继续进行染色操作或将细胞储存于 -4°C 的 PBS 溶液中过夜。

C. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5x105 至 1x106 个细胞。)
  2. 对细胞进行离心分离,并丢弃上清液。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 在室温 (20-25°C) 下孵育 1 小时。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。如果使用直接偶联抗体,则跳到步骤 9。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光素偶联的二抗(按建议的稀释比例用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
  7. 在室温 (20-25°C) 下孵育 30 分钟。避光保存。
  8. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  9. 在 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。

修订于 2019 年 8 月

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