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针对小鼠脾细胞 T 细胞中 FoxP3 的流式细胞术实验步骤

针对: FoxP3 (D6O8R) XP® Rabbit mAb #12653

A. 溶液和试剂

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  • 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。
  • 甲醛(无甲醇)。
  • 2% 甲醛(在 PBS 中稀释的甲醛原液;在实验当天新鲜制备)。
  • Triton™ X-100
  • 1X ACK Lysis Buffer:将 8.29 g NH4Cl、1 g KHCO3、37.2 mg EDTA 溶解在 1L 的总量中;将 pH 调节至 7.2–7.4。储存在 4°C。
  • 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9988) 溶解在 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. 固定

:按照制造商的要求,应在固定/通透前对活细胞进行 CD4 和 CD25 抗体表面染色。

  1. 使用 100 µm 尼龙网状细胞过滤器分离脾脏细胞,然后采集到冷却的 PBS 中。
  2. 通过离心分离收集细胞,随后在 ACK Lysis Buffer 中重悬细胞 5 分钟。(红细胞裂解)。
  3. 通过离心分离用孵育缓冲液洗涤。
  4. 以每支测试管 5–10 x 105 个细胞/100 µl 孵育缓冲液的浓度重悬新鲜分离的鼠源脾脏细胞。
  5. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  6. 在 500 µl 2% 甲醛中重悬细胞。
  7. 在室温下固定 15 分钟。
  8. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

C. 通透

  1. 向细胞团添加 1ml 0.3% Triton™ X-100(在 PBS 中按体积分数计量)。
  2. 涡旋振荡后室温静置 30 分钟。
  3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

D. 免疫染色

  1. 在 100 µl FoxP3 (D6O8R) XP® Rabbit mAb #12653工作溶液中重悬细胞沉淀物(按 1:200 稀释的抗体储存在孵育缓冲液中)。
  2. 室温孵育 1 小时。
  3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
  4. 如果使用荧光染料偶联的一抗,则在 350 µl 孵育缓冲液中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析;对于非偶联或生物素化的一抗,继续进行步骤 5。
  5. 在荧光染料标记的二抗中重悬细胞,并按照制造商建议的稀释度在孵育缓冲液中稀释。
  6. 室温孵育 30 分钟。
  7. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
  8. 在 350 μl 孵育缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。
  9. FoxP3 在可针对 CD25 建立的且对 CD4+ T 淋巴细胞设门的二维双参数散点图上描绘。

发布​于 2013 年 6 月 

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