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使用偶联的二抗进行胞外染色的流式细胞术实验步骤

A. 溶液和试剂

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS): 将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶解在 800 mL 蒸馏水 (dH2O) 中。用 HCl 调整 pH 值至 7.4,使其容量达到 1 升。室温保存。
  2. 甲醛(无甲醇)。
  3. 孵育缓冲液: 将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在 100mL 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. 固定

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 在 0.5-1 ml PBS 中短暂重悬细胞。添加甲醛,直至最终浓度为 2-4%。
  3. 在 37°C 下固定 10 分钟。
  4. 添加 5 ml PBS 并通过离心润洗。
  5. 在 5 ml PBS 中重悬细胞。
  6. 继续染色或将细胞储存在含有 0.1% 叠氮化钠的 PBS 中(在 +4°C 下)。

C. 使用未标记的一抗或接合后的二抗进行染色

:对于单克隆抗体,允许使用同型匹配的对照;对于多克隆抗体,允许使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将 0.5-1x106 细胞分装到每个测试管中(按容量)。
  2. 添加 2-3 ml 孵育缓冲液到每支试管,随后通过离心润洗。重复操作。
  3. 每个测试管用 100 μl 孵育缓冲液中重悬细胞。
  4. 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
  5. 按照适当的稀释度向测试管中加入一抗(参见抗体说明书了解合适的稀释度)。
  6. 在室温下孵育 30-60 分钟。
  7. 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
  8. 在荧光物质标记的二抗*中重悬细胞,并按照制造商建议在孵育缓冲液中稀释。
  9. 在室温孵育 30 分钟。
  10. 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
  11. 在 0.5 ml PBS 中重悬细胞,并用流式细胞术进行分析。

*推荐的二抗:

兔抗

鼠抗

抗大鼠

发布​于 2009 年 1 月 

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