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流式细胞术实验步骤(流式)

重要事项:请参阅产品数据表首页或产品网页上的应用版块,以确定该产品是否已经验证且可用于流式细胞术 (F)。请参阅产品网页上的产品专用流式细胞术实验步骤,以了解相应的固定和通透条件以及建议的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。
  2. 16% 甲醛(无甲醇)。
  3. 100% 甲醇(如果需要)
  4. 孵育缓冲液:在 100 ml 1 X PBS 中溶解0.5牛血清白蛋白 (BSA) (#9998)。储存在 4°C。
  5. 二抗:抗小鼠(#4408#8890#4410#8887)、抗兔(#4412#8889#4414#8885)、抗大鼠(#4416#4418

B. 固定

:如果要进行活细胞染色,则继续进行免疫染色(D 部分)。请参阅产品网页和产品专用实验步骤,以确定产品是否可用于活细胞染色。

  1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
  2. 用 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。添加甲醛并使其终浓度为 4%。
  3. 在室温下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。

C. 通透

:请参阅产品网页上的产品专用实验步骤,以了解正确的通透条件。并不是所有产品都可用甲醇通透处理。

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度,以通透细胞。
  2. 在冰上孵育 30 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。
  2. 如果需要,通过离心分离以及足够的 1X PBS 来洗涤细胞,以去除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释一抗(按照推荐的稀释比例在孵育缓冲液中配制)中重悬细胞。
  4. 在室温下(固定细胞)孵育 1 小时或在冰上(活细胞)孵育 15-30 分钟。
  5. 通过离心分离,用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。如果使用直接标记的抗体,则跳到步骤 9。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光染料标记的二抗(按建议的稀释度在孵育缓冲液中配制)中重悬细胞。
  7. 在室温下(固定细胞)或在冰上(活细胞)孵育 30 分钟。
  8. 通过离心分离,用孵育缓冲液洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  9. 在 1X PBS 中重悬细胞并用流式细胞分析仪进行分析;或者,如要进行 DNA 染色或活/死细胞识别,则继续进行可选的 DNA 染色(E 部分)。

E. 可选的 DNA 染料(固定细胞)或活/死细胞识别染料(活细胞)

  1. 在 0.5 ml DNA 染料或活/死细胞识别染料(如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087)中重悬细胞。
  2. 在室温下(固定细胞)或在冰上(活细胞)孵育 5 分钟。
  3. 如果需要,在 PBS 中离心洗涤。在流式细胞分析仪上分析细胞。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2017 年 7 月

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