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流式细胞术 FoxP3/转录因子固定和通透实验方案

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Kit #43481 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

  1. FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent (1X) (#58766)
  2. FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate (4X) (#44931):使用 FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent (1X) 将所需量稀释成 1X 工作溶液
  3. FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer (10X) (#68751):使用反渗透去离子 (RODI) 水或同等级别的水将所需量稀释成 1X 工作溶液。用于所有洗涤步骤及固定后的抗体孵育。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活性染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。访问我们的列表,了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定和通透

:固定前,应分离贴壁细胞或组织,使它成为单细胞悬浮液。如果使用全血,则需在固定前使用 RBC Lysis Buffer (#46232) 裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。

:根据建议的染料产品实验步骤,Ghost Dye(TM) Violet 510 Viability Dye #59863 等可固定的死活细胞鉴定染料应在固定前添加。去除多余染料后继续进行固定。

:靶向 CD 标记物或其他细胞外表位的抗体可在固定前添加。在固定过程中,这类抗体保持结合目的靶标。固定前可进行一个洗涤步骤,但没有必要。

:理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

  1. 进行离心使细胞沉淀,并去除上清液。
  2. 在按照上述制备的 1 mL 的 FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization 1X 工作溶液中重悬细胞。混匀以解离沉淀物,并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下孵育 30-60 分钟。避光保存。
  4. 用足够的 1X FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer 离心分离来洗涤。丢弃上清液。重复操作。

C. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。(通常,每次实验 5x105 至 1x106 个细胞。)
  2. 在按建议稀释度用 1X FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer 制备的 100 µl 稀释抗体中重悬细胞。请参阅个别抗体数据表或产品网页,了解建议的稀释度,或通过滴定确定。
  3. 在室温 (20-25°C) 下孵育 1 小时。避光保存。
  4. 用足够的 1X FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer 离心分离来洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  5. 如果使用荧光素偶联的一抗,则在 200-500 µl 1X FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析;对于非偶联一抗,继续进行下一步骤。
  6. 在荧光素偶联的二抗中重悬细胞,二抗按建议的稀释度用 1X FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer 稀释。
  7. 在室温 (20-25°C) 下孵育 30 分钟。避光保存。
  8. 用足够的 1X FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer 离心分离来洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  9. 在 200-500 µl 1X FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上进行分析。
 
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