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流式细胞术 BrdU 修饰实验步骤

针对: BrdU (Bu20a) Mouse mAb #5292

A. 溶液和试剂

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS): 将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶解在 800 mL 蒸馏水 (dH2O) 中。用 HCl 调整 pH 值至 7.4,使其容量达到 1 升。室温保存。
  2. BrdU(5-溴-2′-脱氧尿苷)EMD biosciences (Cat. #203806)
  3. 乙醇,无水变性,组织学级,100% 和 95%
  4. 1.5M 盐酸
  5. 孵育缓冲液: 将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在 100 mL 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. BrdU 掺入和样本制备

  1. 在新鲜温热的培养基中加入 BrdU,直至最终浓度为 0.03 mg/mL。搁置在一边。
  2. 通过离心分离从试管中采集约 5000 万个细胞,并吸干上清液。
  3. 将 2 ml 含 BrdU 的培养基添加至细胞沉淀物中,涡旋振荡后在 37°C 下孵育 30 分钟。
  4. 通过离心分离使细胞成团并吸干培养基。
  5. 将 2 ml 冷却的 70% 乙醇添加至细胞沉淀物中并且混合均匀。
  6. 室温下固定细胞 5 分钟。
  7. 加入 2–3 ml PBS,并通过离心分离润洗三次。
  8. 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
  9. 加入 2–3 ml PBS 后通过离心分离润洗两次。
  10. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

:对于单克隆抗体,使用同型匹配的对照组;对于多克隆抗体,使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将 0.5-1 x 106 个细胞分装入每个试验管(以体积计)。
  2. 添加 2-3 ml 孵育缓冲液至每根试管,随后通过离心分离润洗。重复操作。
  3. ​在每个测试管中加入100 μl 孵育缓冲液重悬细胞。
  4. 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
  5. 向测试管加入适当稀释度的非偶联的一抗(参阅抗体数据表了解合适的稀释度)。
  6. 在室温下孵育一小时。
  7. 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
  8. 在荧光染料偶联的二抗* 中重悬细胞,二抗按照建议的稀释度稀释在孵育缓冲液中。
  9. 在室温孵育 30 分钟。
  10. 按照前述说明,通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
  11. 在 0.5 ml PBS 中重悬细胞,并用流式细胞分析仪进行分析;或者继续步骤 D1 进行 DNA 染色。

D. 可选的 DNA 染色

  1. 在 0.5 ml DNA 染料中重悬细胞(如 DRAQ5® #4084)。
  2. 在室温下孵育至少 5 分钟。
  3. 用流式细胞分析仪分析 DNA 染色的细胞。

*推荐的二抗:

鼠抗

发布​于 2009 年 12 月 

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