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用于检测转录因子的流式细胞术 (F) 实验步骤

A. 溶液和试剂

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。
  2. 甲醛(无甲醇)。
  3. 2% 甲醛(在 PBS 中稀释的甲醛原液;在实验当天新鲜制备)。
  4. Triton™ X-100
  5. 孵育缓冲液:将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解在 100 ml 1X PBS 中。储存在 4°C。

B. 固定

:按照制造商的要求,应在固定/通透前对活细胞进行表面抗原免疫染色。

  1. 在每个测试管中,将含有 1–2 x 106 个细胞的新鲜分离的细胞悬浮液调整至 100 μl 孵育缓冲液。
  2. 按照制造商建议的容量或浓度添加表面抗原抗体到测试管中,随后放在冰上孵育 30 分钟。
  3. 添加 2 ml 孵育缓冲液后,通过离心分离进行洗涤。
  4. 抽吸上清液后,重悬在 500 μl 的 2% 甲醛中。
  5. 在室温下固定 15 分钟。
  6. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

C. 通透

  1. 向细胞团添加 1ml 0.1% Triton™ X-100(在 PBS 中按体积分数计量)。
  2. 重悬并在室温下静置 30 分钟。
  3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

D. 免疫染色

  1. 在 100 μl 抗体工作液中重悬细胞团,稀释于孵育缓冲液中,稀释度按照抗体说明书或产品网页说明。
  2. 室温孵育 1 小时。
  3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
  4. 如果使用荧光染料标记的一抗,则在 350 μl 孵育缓冲液中重悬细胞,并使用流式细胞分析仪进行分析;对于未标记或生物素化的一抗,则继续执行步骤 5。
  5. 在荧光染料标记的二抗中重悬细胞,并按照制造商建议的稀释度在孵育缓冲液中稀释。
  6. 室温孵育 30 分钟。
  7. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
  8. 在 350 μl 孵育缓冲液中重悬细胞,并使用流式细胞术进行分析。

发布​于 2013 年 12 月 

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