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酶免疫分析试剂盒实验步骤

A. 试剂制备

  1. 使用前,让全部微孔板条达到室温。
  2. 通过在 Milli-Q 或同等纯化的水中稀释 20 X 洗涤缓冲液(包含于每个试剂盒中),制备 1 X 洗涤缓冲液。
  3. 在 Milli-Q 或同等纯化的水中稀释 10 X Cell Lysis Buffer #9803 至 1 X。应当每次现添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。这种缓冲液可以贮存在 4°C 供短期使用(1–2 周)。

B 细胞裂解物制备

:这个步骤用于 96 孔组织培养板。可以在对其修改后用于其他组织培养板(6、12、24 或 48 孔)。

  1. 将目的细胞铺种于 96 孔板中(一般在 6–100 X 103个细胞/孔之间)并且在适宜的细胞培养条件下孵育过夜
  2. 用 200 µl 温暖的 PBS 润洗细胞,随后在无血清培养基中添加测试化合物并且将细胞孵育所需时间段。
  3. 用 200 µl 冰冷的 PBS 润洗细胞 2 次,并且随后添加 100μl/孔 1 X 裂解缓冲液,于冰上放置 510 分钟。

:如果观察到细胞残片,可以通过短暂离心平板移除它,并且将清亮裂解物转移至新的 96 孔板。

C. 测定

  1. 让全部试剂盒组分达到室温。
  2. 添加 50 µl HRP 连接的靶标溶液和 50μl 样品至抗体包被的分析平板。盖住平板并且在水平圆周式平板摇床上室温孵育 3 小时。
  3. 弃去平板内容物并用 200μl/孔 1 X 洗涤缓冲液洗涤各孔 4 次。确保每次洗涤后弃去全部液体,但不应让孔完全干燥。
  4. 添加 100μl TMB Substrate。
  5. 在室温孵育 30 分钟。

:随着显色进展,观察颜色,因为可能需要在第 30 分钟之前终止反应。

  1. 添加 100μl STOP Solution。
  2. 测量吸光度在 450 nm(为得到最佳结果,在添加 STOP Solution 后 30 分钟内读取平板)。

:为了确定受检物质的绝对量,需要每次都生成标准曲线。请遵循产品数据表上的详细实验步骤以确定标准曲线的浓度范围。

发布​于 2010 年 4 月 

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