针对： PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit (Fluorescent Readout) #12923
A. 制备细胞裂解物
- 解冻 1X Cell Lysis Buffer #7018，充分混匀。向 1X Cell Lysis Buffer 添加 Protease Inhibitor Cocktail (100X) #5871。裂解缓冲液保存在冰上。
- 去除培养基，细胞用冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
- 去除 PBS 并添加冰冷的 1X Cell Lysis Buffer。对于黏附细胞，每块平板（直径为 10cm）使用 0.5ml 1X Cell Lysis Buffer #7018。在冰上孵育 2 分钟。
- 将裂解物转移到微量离心管，并在 4°C 下以最大转速微量离心分离 2 分钟。
- 将上清液转移到新试管。上清液是细胞裂解物，可立即使用或按一次使用的等量样品保存在 -80°C 下。
- 在进行检测前，立即用 Array Diluent Buffer 将裂解物稀释至 0.2-1.0 mg/ml。放置在冰上。
B. 检测流程
- 使用前，将玻片和封闭缓冲液放在室温下。
- 用去离子水稀释 20X Array Wash Buffer 来制备 1X Array Wash Buffer。用 19 ml 去离子水稀释 1 ml 20X Array Wash Buffer。标记为 1X Array Wash Buffer。保存在室温下。
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按照如下流程制备 1X Detection Antibody Cocktail：
仅使用 1 块：用 1350 µl Array Diluent Buffer 稀释 150 µl 10X Detection Antibody Cocktail。
使用 2 块：用 2700 µl Array Diluent Buffer 稀释 300 µl 10X Detection Antibody Cocktail。
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按照如下所述制备 1X DyLight 680-linked Streptavidin：
仅使用 1 块：用 1350 µl Array Diluent Buffer 稀释 150 µl 10X DyLight 680-linked Streptavidin。
使用 2 块：用 2700 µl Array Diluent Buffer 稀释 300 µl 10X DyLight 680-linked Streptavidin。
*保存在冰上，避光。
- 将多孔垫片粘到玻片上（参见底部结果图）：
- 将多孔垫片朝下放在实验台上（硅胶层应朝上）。拆下保护性塑料膜。
- 小心地将玻片放在多孔垫片上面，并使硝化纤维垫朝下，同时将垫与垫片开口对齐。垂直定向玻片时，方向线应出现在左上角。
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将金属夹插入垫片凹槽中，并将其旋转进入锁定位置。确保夹子与玻片上的方向线在同一侧。
注：其中一个夹子在上棱处刻有一个小圆点，以帮助将垫放到位（参见玻片架照片）。
- 将夹子滑到位。
- 按照相同的方法将未标记的金属夹放到架子的另一侧，并将其滑到位。
- 组装芯片可立即使用。
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向每孔添加 100 µl Array Blocking Buffer，并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 15 分钟。
注：切勿让垫片干燥，直至步骤 14 之后。
- 将液体轻弹进水槽或其他恰当的废物容器中，以倒出 Array Blocking Buffer。每孔加入 75 µl 稀释的裂解物，并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 2 小时（或在 4°C 下孵育过夜）。
- 将液体轻弹进水槽或其他恰当的废物容器中，以倒出孔内含物。向每孔添加 100 µl 1X Array Wash Buffer，并在定轨摇床上室温孵育 5 分钟。重复 3 次以上。轻轻倒出孔内容物。
- 向每孔添加 75 µl 1X Detection Antibody Cocktail，并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 1 小时。
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如步骤 8 中一样，用 100 µl 1X Array Wash Buffer 洗涤 4-5 分钟。
注：从现在开始，保持玻片避光。
- 每个孔加入 75 µl 1X DyLight 680-linked Streptavidin，并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 30 分钟。
- 如步骤 8 中一样，用 100 µl 1X Array Wash Buffer 洗涤 4-5 分钟。
- 将金属夹底部拉离玻片中心，以移除多孔垫片，随后分开玻片和垫片。
- 将玻片朝上放在一个塑料盘中（最好是一个清洁的吸管端盒盖）。用 10 ml 去离子水洗涤一次，持续 10 秒。
- 将玻片从塑料盘中取出，并让其彻底干燥。
- 使用荧光数字显影系统（激发光 680 nm，检测光 700 nm）捕获玻片图像。使用市场上可买到的芯片图像分析软件对印迹强度进行定量。
DyLight 是 Thermo Fisher Scientific, Inc. 及其子公司的注册商标。
