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ELISA 实验步骤 - 针对产品:12923

针对: PathScan® Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit (Fluorescent Readout) #12923

A. 制备细胞裂解物

  1. 解冻 1X Cell Lysis Buffer #7018,充分混匀。向 1X Cell Lysis Buffer 添加 Protease Inhibitor Cocktail (100X) #5871。裂解缓冲液保存在冰上。
  2. 去除培养基,细胞用冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 去除 PBS 并添加冰冷的 1X Cell Lysis Buffer。对于黏附细胞,每块平板(直径为 10cm)使用 0.5ml 1X Cell Lysis Buffer #7018。在冰上孵育 2 分钟。
  4. 将裂解物转移到微量离心管,并在 4°C 下以最大转速微量离心分离 2 分钟。
  5. 将上清液转移到新试管。上清液是细胞裂解物,可立即使用或按一次使用的等量样品保存在 -80°C 下。
  6. 在进行检测前,立即用 Array Diluent Buffer 将裂解物稀释至 0.2-1.0 mg/ml。放置在冰上。

B. 检测流程

  1. 使用前,将玻片和封闭缓冲液放在室温下。
  2. 用去离子水稀释 20X Array Wash Buffer 来制备 1X Array Wash Buffer。用 19 ml 去离子水稀释 1 ml 20X Array Wash Buffer。标记为 1X Array Wash Buffer。保存在室温下。
  3. 按照如下流程制备 1X Detection Antibody Cocktail:

    仅使用 1 块:用 1350 µl Array Diluent Buffer 稀释 150 µl 10X Detection Antibody Cocktail。

    使用 2 块:用 2700 µl Array Diluent Buffer 稀释 300 µl 10X Detection Antibody Cocktail。

  4. 按照如下所述制备 1X DyLight 680®-linked Streptavidin:

    仅使用 1 块:用 1350 µl Array Diluent Buffer 稀释 150 µl 10X DyLight 680®-linked Streptavidin。

    使用 2 块:用 2700 µl Array Diluent Buffer 稀释 300 µl 10X DyLight 680®-linked Streptavidin。

    *保存在冰上,避光。

  5. 将多孔垫片粘到玻片上(参见底部结果图):
    1. 将多孔垫片朝下放在实验台上(硅胶层应朝上)。拆下保护性塑料膜。
    2. 小心地将玻片放在多孔垫片上面,并使硝化纤维垫朝下,同时将垫与垫片开口对齐。垂直定向玻片时,方向线应出现在左上角。
    3. 将金属夹插入垫片凹槽中,并将其旋转进入锁定位置。确保夹子与玻片上的方向线在同一侧。

      :其中一个夹子在上棱处刻有一个小圆点,以帮助将垫放到位(参见玻片架照片)。

    4. 将夹子滑到位。
    5. 按照相同的方法将未标记的金属夹放到架子的另一侧,并将其滑到位。
    6. 组装芯片可立即使用。
  6. 向每孔添加 100 µl Array Blocking Buffer,并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 15 分钟。

    :切勿让垫片干燥,直至步骤 14 之后。

  7. 将液体轻弹进水槽或其他恰当的废物容器中,以倒出 Array Blocking Buffer。每孔加入 75 µl 稀释的裂解物,并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 2 小时(或在 4°C 下孵育过夜)。
  8. 将液体轻弹进水槽或其他恰当的废物容器中,以倒出孔内含物。向每孔添加 100 µl 1X Array Wash Buffer,并在定轨摇床上室温孵育 5 分钟。重复 3 次以上。轻轻倒出孔内容物。
  9. 向每孔添加 75 µl 1X Detection Antibody Cocktail,并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 1 小时。
  10. 如步骤 8 中一样,用 100 µl 1X Array Wash Buffer 洗涤 4-5 分钟。

    :从现在开始,保持玻片避光。

  11. 每孔加入 75 µl 1X DyLight 680®-linked Streptavidin,并用密封带封闭。在定轨摇床上室温孵育 30 分钟。
  12. 如步骤 8 中一样,用 100 µl 1X Array Wash Buffer 洗涤 4-5 分钟。
  13. 将金属夹底部拉离玻片中心,以移除多孔垫片,随后分开玻片和垫片。
  14. 将玻片朝上放在一个塑料盘中(最好是一个清洁的吸管端盒盖)。用 10 ml 去离子水洗涤一次,持续 10 秒。
  15. 将玻片从塑料盘中取出,并让其彻底干燥。
  16. 使用荧光数字显影系统(激发光 680 nm,检测光 700 nm)捕获玻片图像。使用市场上可买到的芯片图像分析软件对印迹强度进行定量。

玻片架照片

DyLight® 是 Thermo Fisher Scientific, Inc. 及其子公司的注册商标。

发布​于 2013 年 11 月 

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