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ELISA-肽测定法实验步骤

A. 溶液和试剂

  1. 碳酸盐缓冲液: 15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3、0.2 g/L NaN3 (pH 9.6)。将 1 μM 合成肽溶于碳酸盐缓冲液中。
  2. 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):为了配制 1 L,添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。调节 pH 至 7.4。
  3. 洗涤缓冲液:含有 0.05% Tween® 20 的 1 X PBS (PBST)
  4. 封闭缓冲液:PBST 中 10 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)
  5. 抗体稀释缓冲液: 3% BSA 稀释于 PBST 中
  6. DELFIA® 铕标记的针对小鼠一抗的 Anti-mouse IgG 或针对兔一抗的 Anti-rabbit IgG (PerkinElmer Life Sciences #AD0124)。
  7. DELFIA® 增强溶液 (PerkinElmer Life Sciences #1244-105)

B. 实验步骤

  1. 将 100μl 1 μM 稀释于碳酸盐缓冲液中的合成肽,加入 96 孔微量滴定板的各孔,在 °C 孵育 过夜4或2°C 孵育 637 小时进行包被。如果肽不结合或不吸附,可尝试 pH 在4–8 内的其他缓冲液。
  2. 用 200 μl/孔的洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。
  3. 用 200 μl/孔的封闭缓冲液在 37 °C 下封闭平板 1 小时。将洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。(如果需要,可以持续 1-2 个月将平板保持在 4°C )
  4. 用抗体稀释缓冲液配制适宜稀释度的一抗 。向每个孔中添加 100μl,并在 37°C 孵育 1 小时。
  5. 用洗涤缓冲液洗涤 3 次。
  6. 添加稀释于 100μl/孔抗体稀释缓冲液中的 67ng/孔 DELFIA 铕标记 Anti-mouse IgG。在 37°C 孵育 30 分钟。
  7. 用洗涤缓冲液洗涤 5 次。
  8. 添加 100μl 增强溶液并在 37°C 孵育 15 分钟。用适宜的时间分辨平板读数仪在 615 nm 读取平板读数。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2007 年 9 月

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