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Caspase-3 活性检测实验步骤

A. 试剂制备

  1. 在 1 ml DMSO 中重新配制 Ac-DEVD-AMC。
  2. 冻试剂解冻后应立即用于进行试验(DTT、Ac-DEVD-AMC)。

:试剂保存在 -20°C 下时可能会发生沉淀。如有必要,加热试剂到 37°C 以溶解沉淀物。

  1. 将一部分检测缓冲液 (2X) 与一部分 dH2O 混合,并添加 DTT(1:200 的稀释比例,最终浓度为 5 mM)来制备 1X 检测缓冲液 A
  2. 将 Ac-DEVD-AMC(1:40 的稀释比)稀释在 1X 检测缓冲液 A 中,以制备底物溶液 B

B. 细胞裂解物制备:在 96 孔板上收集裂解物

  1. 1. 将细胞放在 96 孔板上,并用相应的检测物质按适当时间进行孵育。一般的细胞数为 5x104 – 2x105 个细胞/孔。
  2. 处理后,以 300xg 的离心力旋转培养板 10 分钟,清除培养基,细胞用冰冷的 PBS 漂洗,以 300xg 的离心力旋转培养板 10 分钟,清除 PBS。
  3. 每孔添加 30 μl 细胞裂解缓冲液 (#7018),并将培养板放在冰上 5 分钟。

:细胞裂解物培养板可保存在 −80°C 下供日后使用。

从皮氏培养皿上收集裂解物:

  1. 处理后,检查细胞的贴壁性。如果细胞从培养板上分离或仅松散被吸附在培养板上,则继续执行步骤 b;如果细胞被紧紧吸附在培养板上,则继续执行步骤 c。
  2. 培养板用现有培养基漂洗,以便将所有细胞收集放入离心管中。以 1000g cpm 的离心力旋转 5 分钟,清除上清液并将细胞裂解缓冲液 (#7018)(0.5 ml/10 cm 培养板)添加到细胞沉淀物。上下吹打几次以使细胞分散开。放在冰上并继续执行步骤 d。
  3. 细胞用冰冷的 PBS 漂洗,随后往培养板添加细胞裂解缓冲液 (#7018)(0.5 ml/10 cm 培养板),培养板放在冰上 5 分钟。从平板刮下细胞并转移至适当的试管。放在冰上并继续执行步骤 d。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 下微量离心分离 10 分钟,并将上清液转移到一根试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 半胱天冬酶活性检测

  1. 1X 检测缓冲液 A 中将细胞裂解物稀释至所需浓度(建议 0.5–4 mg/ml)。如果细胞裂解物来自 96 孔板,则无需进行稀释。
  2. (可选)将 25 µl 阳性对照 AMC(随试剂盒提供)与 200 μl 1X 检测缓冲液 A 混合以作为阳性对照。
  3. 在适合用于荧光检测的黑色培养板上,将 200 µl 底物溶液 B 和 25 µl 裂解物溶液混合在一起。

:我们建议立即读取培养板,并记录 0 小时处的 RFU 读数。这将有助于确定在孵育结束时 RFU 是否发生明显变化。

:该实验步骤已经在 384 孔板样式中进行了测试,请根据培养板容量按比例调整容量。例如,如果使用 384 小容量培养板,则使用 20 µl 底物溶液 B 和 2.5 µl 裂解物。

  1. 在 37°C 下,培养板放在阴暗处孵育。
  2. 使用 380 nm 的激发波长和 420–460 nm 的发射波长读取荧光读板机上的 RFU。

:孵育 1 小时后,我们建议读取培养板。如果信号太弱,则延长孵育时间,以观察信号强度是否发生明显变化。如果未观察到信号强度明显增强,则需要加入更多裂解物。

发布​于 2012 年 10 月 

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