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Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) Activity Assay Kit #12581 的检测实验步骤

产品专有: Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) Activity Assay Kit #12581.

A. 仪器

  1. 使用约 530 nm 激发波长和 590 nm 发射波长读取 96 孔板的读板机。
  2. 96 孔黑色培养板。

B. 试剂配制

  1. 请重新配制以下冻干组分:
    组分 dH2O 体积
    G6PDH 底物 250 μL
    G6PDH 显色剂 100 μL
    G6PDH 阳性对照 50 μL
    NADP 100 μL
    G6PDH 辅因子 100 μL
  2. 计算检测次数:样品 + 阳性对照数量。
  3. 根据计算的检测次数,稀释总检测溶液。
    • 对于 96 孔板,建议 70 μL/孔
    • 对于 384 孔板,建议 20 μL/孔。
  4. 检测次数 = 10 份样品 (n=3) + 3 份阳性对照

    • 96 孔板:70 μL/孔 x 33 份样品 = 2310 μL + 10% = 约 2500 μL
    • 384 孔板:20 μL/孔 x 33 份样品 = 660 μL + 10% = 约 750 μL
  5. 配制阴性对照溶液(参见表格)
  6. 注:请勿将 G6PD 底物添加到阴性对照溶液中。

  7. 配制阳性对照溶液(参见表格)
  8. 配制 1X 细胞裂解缓冲液
  总检测溶液 (μL) 阴性对照溶液 (μL) 阳性对照溶液 (μL)
G6PD 底物 (40X) 62.5 0 0
G6PD 显色剂 (100X) 25 3.3 0
G6PDH 辅因子 (100X) 25 3.3 0
G6PD 阳性对照 (100X) 0 0 1
NADP+ (100X) 25 3.3 0
G6PD 检测缓冲液 (1X) 2362.5 320 99
共计 (μL)(约 10% 的额外体积) 2500(30 份样品 + 3 份阳性对照) 330 100

表 1:96 孔板中 10 份样品的计算示例(所有样品均为三份)

  总检测溶液 (μL) 阴性对照溶液 (μL) 阳性对照溶液 (μL)
G6PD 底物 (40X) 19 0 0
G6PD 显色剂 (100X) 7.5 1 0
G6PDH 辅因子 (100X) 7.5 1 0
G6PD 阳性对照 (100X) 0 0 1
NADP+ (100X) 7.5 1  
G6PD 检测缓冲液 (1X) 708.5 97 99
共计 (μL)(约 10% 的额外体积) 750(30 份样品 + 3 份阳性对照) 100 100

表 2:384 孔板中 10 份样品的计算示例(所有样品均为三份)

C. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 将靶细胞培养至融合度为 80–90% 并吸干培养基。
  2. 按所需时间添加含有调节分子的新鲜培养基。
  3. 吸干培养基,细胞用冰冷的 1 X PBS (#9872) 漂洗一次。
  4. 吸干 PBS,每块平板(直径为 10cm)添加 0.5ml 冰冷的 1 X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF。
  5. 培养板放在冰上孵育 5 分钟。
  6. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  7. 在冰上超声处理裂解物。
  8. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。
  9. 按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

D. 检测实验步骤

  1. 用 G6PD 检测缓冲液 (1X) 稀释样品至所需浓度。
  2. 向一块黑色 96 孔板添加 70 μL 总检测溶液和 30 μL 样品。混匀。(或向一块 384 孔板添加 20 μL 总检测溶液和 10 μL 样品。)
  3. 阴性对照:向三个孔添加 100 μL 阴性对照溶液。(向 384 孔板添加 30 μL 阴性对照溶液。)
  4. 阳性对照:向三个孔添加 70 μL 总检测溶液和 30 μL 阳性对照溶液。混匀。(向 384 孔板添加 20 μL 总检测溶液和 10 μL 阳性对照溶液。)
  5. 在 37°C 孵育 15 分钟。
  6. 使用约 540 nm 的激发波长和约 590 nm 的发射波长读取读板机上的 RFU。

发布​于 2013 年 11 月 5 日 

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