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成功进行流式细胞术的技巧

要进行胞内流式细胞术,需进行细胞固定和通透,才能让抗体渗透并随后结合靶标,而不会破坏细胞形态。

下面,我们讨论多种关键因素,以确保成功的实验设计,尤其是在研究翻译后修饰 (PTM) 时。

对 PTM(如磷酸化)进行流式细胞分析,需要对通路激活临界窗口期内的细胞进行固定。使用 4% 甲醛(不含甲醇)固定可最佳交联胞内蛋白和所有相关修饰。此外,让负责去除修饰的酶活性(如磷酸酶)失活。如果交联范围包括靶标表位,则对于某些靶标来说,可能需要更低浓度的甲醛。

通过逐滴添加冰冷的 90% 甲醇进行通透处理可保持细胞结构完整性,同时让抗体高效渗透,但不会让之前经乙醛固定的 PTM 表位变性 (1)。

参考文献:

  1. Krutzik PO, Nolan GP (2003) Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A 55(2), 61–70.

体外刺激全血会干扰血基质中的外周血细胞,导致模型在通路信号转导和其他细胞过程方面更具生理相关性。用 4% 甲醛固定会让蛋白质相互作用变得稳定,并且随后用 0.1% Triton X-100 处理会裂解红细胞 (RBC) (1)。用 50% 甲醇进行通透可保留表面标记物完整性,从而同时分析表面和胞内靶标

胞内酪氨酸激酶 Btk 在 B 细胞中选择性表达

Btk

Btk (D3H5) Rabbit mAb #8547: 人全血细胞按照 CST 的流式细胞术备选实验步骤中的说明进行固定和通透处理,并使用 #8547 染色。前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 用于对淋巴细胞设门 (A)。样品用 CD3-PE 和 CD19-APC 共染色,以区分 T 和 B 细胞亚群 (B)。B(红色)和 T(蓝色)细胞群设门用于表示 Btk 平均荧光强度的柱状图 (C)。

参考文献:

  1. Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV (2005) Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A 67(1), 4–17.

设计实验时,解释细胞系统的复杂性始终很重要。在某些情况下,基底修饰水平可能会很高,因此,刺激目的通路不会提供任何其他可检测的信号,这可以解释为是一个假阴性结果。对于磷酸化蛋白,这是一个常见的现象。要解决这个问题,固定和通透的样品可用磷酸酶处理,以去除蛋白的磷酸基,随后检测指示高基底磷酸化水平的信号是否减弱。血清饥饿或激酶抑制剂处理会降低活细胞中的内源性磷酸化水平。相反,由于存在内源性磷酸酶活性,可能会难以捕捉瞬变的磷酸化活动,在这种情况下,用磷酸酶抑制剂处理有助于维持磷酸化信号。

磷酸酶处理显示 S6 核糖体蛋白的基底磷酸化水平。

A

B

C

磷酸化 S6 核糖体

Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236)(D57.2.2E) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor®488 Conjugate) #4803: 人全血细胞按照 CST 流式细胞术备选实验步骤进行固定和通透,随后不作处理 (A)、或用 λ 磷酸酶 (B) 或 TPA #4174 (C) 处理,之后用 #4803 染色。

对照可让研究人员确定存疑的测定法是否能正常发挥作用。如果要考虑很多因素,精心的对照设计对解释流式细胞实验的结果尤为重要。考虑到这一点,我们建议在您的工作流程中加入以下类型的对照:

  1. 设置或仪器对照,用于正确调整仪器电压增益和补偿
  2. 设门对照,用于区分特异性和非特异性结合
  3. 实验对照,提供具有生物学意义的信息。

下表列出了有关以上三类的每类的相应对照。

对照 为何需要?
未染色细胞
  • 阴性对照,可用于确定背景和自发荧光
  • 设置 PTM 电压
完全染色的细胞
  • 检查是否有任何超标事件
  • 设置 PTM 电压
染有单独荧光标记物的细胞样本/珠子
  • 补偿
同型对照
  • 设门 – 去除分析中的非特异性染色
荧光扣除对照 (Fluorescence Minus One, FMO) 染色
  • 设门 - 减少荧光溢漏
未刺激或未经处理的样品
  • 实验阴性对照
阳性细胞(经刺激)
  • 实验阳性对照
染有死活细胞鉴定染料(如碘化丙啶)的细胞
  • 区分活细胞与非活细胞
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