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通过免疫组织化学法 (IHC) 了解组织中的蛋白表达

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检测和分析蛋白表达

什么是免疫组织化学 (IHC)?

免疫组织化学 (IHC) 涉及使用特异性一抗对组织样品中的细胞蛋白进行标记,并使用检测试剂可视化靶标。可以使用 IHC 通过显色法检测或荧光检测评估蛋白质表达。两种检测体系均依赖于一抗介导的抗原识别。显色 IHC 利用酶催化色原在抗原位置处的沉积,而荧光 IHC 利用荧光基团通过直接或间接免疫荧光法来辅助可视化关注抗原。

IHC 染色实例 PDL1 B7H4 细胞角蛋白

使用 PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684(左)、B7-H4 (D1M8I) XP® Rabbit mAb #14572(中)和 Pan Keratin (C11) Mouse mAb #4545 对卵巢癌连续切片进行免疫组织化学染色,分别使用荧光检测系统和显色法检测系统评价这两种免疫检查点蛋白质的表达模式和水平。注: 拍摄的图像为不同观察视野。

两种检测系统均揭示了等同的蛋白质水平和分布细节。因此,检测方法的选择完全取决于实验目标。

何时选择 IHC?

IHC 常用于确认肿瘤或其他组织癌变的形态特征。在保持原组织成份、细胞特征以及结构的情况下,IHC 利用抗体检测和分析蛋白质表达。

在 CST,专门从事 IHC 的科学家们检测了大量抗体,并只推荐了最适合该应用的抗体 — 以确保您的检测能够首次成功,且每次都是如此。

IHC 70076 肠道

F4/80 (D2S9R) XP® Rabbit mAb #70076: 使用 70076# 对石蜡包埋的小鼠肠细胞进行的 IHC 分析。

在设计 IHC 实验时,您应考虑哪些变量?

在 CST ,专门从事 IHC 的科学家们检测了大量的抗体,并只推荐了最适合该应用的抗体。我们的科学家对多种抗原修复和免疫染色方法进行了检测,以确定 IHC 中各抗体在 IHC 中的最佳使用条件。此外,科学家还研制了 IHC 配套试剂,以加强抗原的检测和提高 IHC 实验步骤的效率。

因为固定时形成的交联可通过阻止抗体与抗原接触来防止抗体结合;因此,通过称为抗原修复的过程来解交联很重要。抗原修复可通过热诱导的方法或者酶解法实现。产品数据表中将明确阐述用于 CST 抗体的推荐方法。

一抗在任何 IHC 测定中都至关重要,对数据质量存在直接影响。质量较差的一抗可导致结果无法解释或存在误解。对于批准用于 IHC 的抗体,需要在单一组织样品超过一次染色阳性。抗体应通过严格的检测过程,以确保其可精确地检测到靶标。

对您的抗体使用效果最优的试剂和实验步骤能够大大改善您的实验结果。

您还必须确保检测到的信号是特异性的。在任何实验中,我们都应考虑包含适当的对照。阳性和阴性对照可为您确定自己的抗体正在检测预定靶标注入信心。

IHC 4513 PLK1 人结肠

PLK1 (208G4) Rabbit mAb #4513: 如图所示,使用 # 4513 采用逐步试剂替代对石蜡包埋的人结肠癌进行的 IHC 分析,显示这些试剂可以区分染色不佳和可发表的结果。

使用 IHC 有哪些挑战?

调整相对较少的变量通常即可解决欠佳的 IHC 染色。调整实验步骤内的关键步骤(如抗原修复)通常可解决这些常见问题(如信号微弱或无信号以及高背景)。

联系我们的高级技术支持团队以回答您有关测定法的问题,包括如下方面的详细信息:

  • IHC 验证
  • IHC 测定法疑难解答
  • Leica® Bond™ 自动染色机实验方案的开发
  • 多重 IHC 测定法实验步骤和疑难解答

使用经验证的 IHC 抗体获得一致的结果

一抗在任何 IHC 测定中都至关重要,对数据质量有直接影响。在 IHC 分析中确定靶标特异性需要多个验证步骤。CST 提供使用福尔马林固定石蜡包埋的 (FFPE) 组织进行严格 IHC 验证的700重组单克隆抗体。内部验证可以让我们的科学家为您提供专家建议,以节省您的时间并加快您获得结果的速度。我们广泛的验证确保我们的所有经 IHC-P 验证的抗体还可用于荧光多重 IHC。

CST 的科学家们视情况使用各种方法来验证每种建议的 IHC 抗体,可确保您使用每种抗体观察到的染色均具有特异性。验证步骤包括:

  • 进行蛋白质印迹法分析,以通过最小交叉反应条带证实分子量正确。
  • 使用已知靶标表达水平的石蜡包埋的细胞沉淀物来验证靶标特异性。
  • 在相关的癌症模型中评估抗体性能,包括但不限于人癌组织阵列、小鼠模型和来自有已知靶标表达水平的细胞系的异种移植物。
  • 对组织切片和细胞沉淀物进行磷酸酶处理,以验证靶标磷酸化特异性。
  • 封闭肽可验证特异性,并排除 Fc 介导的结合和其他非特异性染色。
  • 彻底的批次检测可确保获得准确 IHC 结果所需的可重复性。
  • 预先决定和指定稀释度和实验步骤;也提供对照试剂。

IHC 12708 细胞沉淀物验证

使用 HER3/ErbB3 (D22C5) XP®Rabbit mAb #12708(顶部小图)对转染人 erbB 家族成员 HER3、EGFR、HER2 和 HER4(从左到右,如图)的石蜡包埋的 293T 细胞沉淀物进行的免疫组织化学分析。使用 EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb #4267(左下图)、HER2/ErbB2 (D8F12) XP® Rabbit mAb #4290(中下图)和 HER4/ErbB4 (111B2) Rabbit mAb #4795(右下图)来确认转染情况。

IHC-5741 封闭肽  人扁桃体

在添加对照肽(左图)或抗原特异性肽(右图)的情况下,使用 Vimentin (D21H3) XP® Rabbit mAb #5741 对石蜡包埋的人扁桃体细胞进行免疫组织化学分析。

IHC 3287 HCC78 异种移植物

免疫组织化学 IHC 3287 HCC78 异种移植物

通过抗体特异性配套产品和对照加速优化

抗体只是实验成功的因素之一。对您的抗体使用效果最优的试剂和实验步骤能够大大改善您的实验结果。为了提高您的 ICH 实验步骤开发和效率和确保您的检测成功,我们的科学家对多种抗原修复和免疫染色方法进行了检测,以确定 IHC 中各抗体的最佳使用条件。我们开发配套试剂以增强抗原检测,从而改善您的结果。

IHC 4267抗原修复

靶向相同蛋白质的抗体可能有不同的首选抗原修复方法。通过在柠檬酸盐缓冲液(左)、EDTA 缓冲液(中)中煮沸,或经胃蛋白酶(右)裂解进行抗原修复后,利用EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb #4267 和一种 EGFR 小鼠单克隆抗体对石蜡包埋人肺癌进行 IHC 分析。对于 #4267,经 EDTA 修复后获得了更强的信号。然而,对于竞争者的 EGFR mouse mAb, 只有经胃蛋白酶裂解后才可获得信号。

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