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流式细胞术

传统上,根据胞外或表面表达的标志物不同,流式细胞术可用于鉴定多种异质细胞库里的不同细胞类型,这种应用通常称为免疫表型分型。然而,这项技术还可轻松地应用于胞内靶标检测,并可成功地应用于复杂信号转导事件的研究。

因此,与检测细胞表面标记物组合,胞内流式细胞术已经演化成一个强大平台,这个平台能够在表型不同的细胞群内部,从单细胞水平上特征性描述信号转导网络。

胞内流式细胞术的优势:

  1. 可同时检测与表面、胞质区室和胞核区室结合的蛋白质
  2. 表型与以下各项直接相关:
    • 胞内蛋白质表达
    • 功能性输出,例如:细胞因子的释放和转录因子的产生
  3. 基于单个细胞的信号转导事件研究
  4. 悬浮状态下细胞的通路激活/抑制作用机制研究
  5. 胞内蛋白质表达的定量评估

与蛋白质印迹分析相比时,胞内流式细胞术可以为信号转导事件研究提供独特的优势。蛋白质印迹法检测来自汇集的细胞群体的蛋白质水平,因此其灵敏度可能不足以识别罕见信号转导事件,特别是低比例特化细胞中发生的事件。这可能错误解读为阴性结果。由于流式细胞术具有在单个细胞水平测量事件的能力,因此它可以识别罕见的信号转导事件(参见下文例子)。

蛋白质印迹法

蛋白质印迹法

胞内流式细胞术

胞内流式细胞术

胞质非受体酪氨酸激酶 Syk 传输来自 B 细胞受体 (BCR) 的信号,并且当 B 细胞受体激活时被磷酸化。
使用 WB 研究未处理的或用 Ig M (10μg/ml) 处理 10 分钟的 PBMC 群体中 Syk 的激活情况。两个组使用 Syk Antibody #2712 通过 WB 对总 Syk 进行分析后,都显示了分子量正确的两个条带。但是,使用 Phospho-Syk (Tyr525/526) (C87C1) rabbit mAb #2710 对磷酸化 Syk 的探测未产生可见条带。Syk 仅在 PBMC 内部的 B 淋巴细胞群体中表达,并且处理后,仅小比例的 B 细胞将显示 Syk 的激活。因此,IgM 处理的影响在蛋白质裂解物内部被削弱,并且使用 WB 进行分析时不可检出。
当通过流式细胞术进行相同分析时,分别用 CD19 细胞和 CD4 细胞、B 细胞和 T 细胞特异性标志物共染色,可以鉴定 B 细胞。可以检查 CD19 阳性和 CD4 阴性 B 细胞的 Syk 磷酸化情况。正如预期的一样,未处理的细胞中不存在 Syk 激活。然而在 IgM 处理后,约 10% 的 B 细胞变成 phospho-Syk 阳性。因此不同于蛋白质印迹法,流式细胞术有能力从不均一的人 PBMC 汇集物中鉴定并且拆分这个微小但真实的 B 淋巴细胞亚群。

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