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染色质免疫沉淀实验方法概述

ChIP 实验概述

染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定法是一种用于在细胞天然染色质背景下探测蛋白质-DNA 相互作用的强大的通用技术 (1,2)。这种测定法用于检测与基因组某个特定区域有关的多种蛋白,或相反,用于检测与某种特殊蛋白有关的基因组的多个区域 (3–6)。此外,ChIP 实验可用于明确某种特殊蛋白-DNA 相互作用的空间和时间关系。例如,ChIP 实验可用于确定各种蛋白因子被募集到某个基因启动子上的特定顺序,或用于“测量”基因激活期间整个基因位点上某种特殊组蛋白修饰的相对数量 (3,4)。除了组蛋白,ChIP 实验还可用于分析转录因子、转录辅因子、DNA 复制因子和 DNA 修复蛋白的结合。

进行 ChIP 实验时,首先用甲醛固定细胞,甲醛是一种可逆的蛋白-DNA 交联剂,可以用来固定或“保留”细胞内发生的蛋白-DNA 相互作用(见方法概述)(1,2)。随后裂解细胞,收集染色质并使用超声处理或酶解碎裂。使用对某种特殊蛋白或组蛋白修饰具有特异性的抗体对染色质进行免疫沉淀。任何与目标蛋白或组蛋白修饰有关的 DNA 序列都会作为交联染色质复合体的一部分进行共沉淀,并且该 DNA 序列的相对数量会在免疫选择过程中达到富集。免疫沉淀后,蛋白质-DNA 交联被逆转,DNA 得以纯化。随后,使用许多不同的方法来检测某种特殊 DNA 序列或序列的富集度。

通常,使用标准 PCR 方法来检测与某种特殊蛋白或组蛋白修饰有关的基因组的 DNA 序列或区域 (1,2)。PCR 用来测量某种特殊 DNA 序列的相对富集度,其中,通过蛋白特异性免疫沉淀以及使用非特异性抗体对照进行免疫沉淀来使 DNA 序列富集。将 PCR 产物转移到琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上,以便进行定量,并测定 DNA 序列相对于输入 DNA 总量(输入比例)的富集水平。富集水平还可表示为高出背景水平的富集倍数(相对于非特异性抗体对照的富集度)。实时 PCR 提供一个更准确、不含凝胶的系统来对 DNA 富集度进行定量。或者,ChIP 实验还可结合基因组覆瓦微芯片 (ChIP on chip) 技术、测序或克隆策略,以便对蛋白-DNA 相互作用和组蛋白修饰进行全基因组分析 (5–8)。

SimpleChIP® Kit 含有对哺乳动物细胞进行 ChIP 实验所需的缓冲液和试剂,适合组蛋白修饰和非组蛋白 DNA 结合蛋白。细胞裂解后,通过使用 Micrococcal Nuclease 进行部分消化来碎裂染色质,以获得大小为 1-5 个核小体的染色质片段。染色质的酶消化较超声处理更为温和,可避免因超声处理期间的不同染色质超声处理功率和乳化而引发的问题,因为这些因素会因蛋白变性和降解而导致染色质碎裂不完全或抗体表位缺失。使用抗体与 ChIP Grade Protein G AgaroseChIP Grade Protein G Magnetic Beads 进行染色质免疫沉淀。在解开蛋白 -DNA 交联后,使用试剂盒中包含的 DNA 纯化吸附柱来纯化 DNA。DNA 纯化吸附柱结合了吸附柱技术的便捷性与独特设计硅胶膜的选择性结合特性,可高效回收 DNA 并去除蛋白污染物,无需进行苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀。DNA 纯化后,使用标准 PCR、定量实时 PCR、芯片 ChIP 扩增、测序或克隆技术等各种方法来分析特定 DNA 序列的富集。

方法概述

ChIP 实验概述

除了提供进行 ChIP 实验所需的缓冲液和试剂之外,SimpleChIP® Kit 还提供供用户测定成功 ChIP 实验的重要对照。该试剂盒含有阳性对照 Histone H3 Antibody、阴性对照 Normal Rabbit IgG Antibody 和引物组,可用于对核糖体蛋白 L30 (RPL30) 基因位点进行 PCR 检测(含有人和小鼠引物组)。组蛋白 H3 是细胞的一种核心染色质组分,可在基因组中结合多数 DNA 序列,包括 RPL30 位点。因此,使用 Histone H3 Antibody 对染色质进行免疫沉淀会使 RPL30 基因富集,而使用 Normal Rabbit IgG 进行免疫沉淀则不会导致 RPL30 基因富集。使用标准 PCR 或定量实时 PCR 方法以及试剂盒中提供的 RPL30 引物组对这种富集进行定量。重要的是,组蛋白 H3 结合基因组内的多数 DNA 序列,因此 Histone H3 Antibody 可作为几乎所有研究位点的阳性免疫沉淀对照,让用户更有信心地成功进行 ChIP 实验。

SimpleChIP® Kit 提供的试剂足以进行多达 6 次染色质制备(或优化)和 30 次免疫沉淀,并且优化后每次实验可使用 4 X 107 个细胞。一次 ChIP 实验可在短达 2 天内完成,并且在使用更多或更少的细胞时可轻松扩大或缩减。

背景参考

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