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使用 SimpleChIP® Kit 进行 ChIp-seq

使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) 进行 ChIp-seq 的优势:

  • 染色质酶消化较超声处理更加温和,并且能更好地保留染色质和抗体表位的完整性,这意味着免疫沉淀效率提高。
  • 免疫沉淀效率提高意味着可增强对蛋白-DNA 位点的检测。
  • ChIP-Grade Protein G Magnetic beads 不含 DNA 封闭试剂,如鲑鱼精 DNA,这意味着不存在下游测序污染。
  • ChIP-Grade Protein G Magnetic beads 不需要进行离心分离,这可使操作更便捷,洗涤更彻底。
  • ChIP-Grade Protein G Magnetic beads 提供更高的敏感性,背景更低,这在检测 DNA-转录因子和辅因子时非常重要。

使用 SimpleChIP® Kit 进行 ChIp-seq

表观遗传学景观含有不同常染色质和异染色质的结构域,这些结构域对不同细胞类型和不同发育阶段均具有独特性。组蛋白的翻译后修饰可介导基因表达的表观遗传调节。例如,组蛋白 H3 Lys4 的三甲基化是一种与活性染色质(常染色质)有关的修饰,而组蛋白 H3 Lys27 的三甲基化则是失活异染色质的标志。

要按全基因组规模来检测组蛋白修饰的局部区域以及转录因子的结合位点,一种强有力的方法便是染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定法。ChIP 实验使用甲醛来将活细胞蛋白共价交联到它们的 DNA 底物上。随后使用针对特异性组蛋白修饰或转录因子所产生的抗体,对 蛋白-DNA 复合体进行免疫沉淀。对沉淀的 DNA 进行纯化,并通过与低聚核苷酸微芯片(ChIP-芯片)杂交或通过高通量 DNA 测序 (ChIP-seq) 来进行分析。通过使用培养的细胞群、在细胞周期或发育的特定时间收集的细胞亚群、或甚至是直接从组织样品中取来的细胞,这些方法可提供一个机会来获得指定细胞类型中 DNA-蛋白相互作用的快照。ChIP-芯片是用于分析全基因组结合位点的第一种方法。但覆盖整个人基因组需要多种 DNA 微芯片,这会导致综合研究的成本较高。ChIP-seq 技术是另外一种方法,在单个测序运行中,它能够检测整个基因组中的结合位点。使用 Illumina GA2 测序仪便可完成,这种测序仪会进行短序列读取,足以将富集的 DNA 片段准确地定位到它们的基因组位置。

通过使用 Cell Signaling Technology 的 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003,我们进行了 ChIP-seq 实验来检测 K562 红白血病细胞系中三甲基化组蛋白 H3 Lys4 和三甲基化组蛋白 H3 Lys27 的表观遗传学特征。按照 SimpleChIP® 实验步骤的说明,使用 K562 细胞来制备染色质,染色质随后用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733Normal Rabbit IgG #2729(作为阴性对照)进行免疫沉淀。通过标准的聚合酶链反应,可确认三甲基化组蛋白 H3 Lys4 和三甲基化组蛋白 H3 Lys27 在已知结合位点的富集情况(结果图 1)。随后使用免疫沉淀的 DNA 来制备库,以用 Illumina GA2 测序平台进行测序。所获得的序列定位至 UCSC Human Genome Assembly (HG18),随后仅再次获取唯一定位的序列。会产生峰值的序列读取次数增加反映出结合位点较富集(结果图 2)。兔单克隆抗体被发现会出现较高的富集,表现在 17 次序列读取的平均峰值高度以及非常低的背景。

使用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 对 K562 染色质进行免疫沉淀。

结果图 1. 使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003 对 K562 染色质与 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751(泳道 1)、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733(泳道 2)或 Normal Rabbit IgG #2729(泳道 3)进行免疫沉淀。纯化的 DNA 使用标准 PCR 方法进行分析,该方法使用对转录激活的 DHFR 基因、HIST1H2AC 基因簇或失活的 MYT1 基因具有特异性的引物。

三甲基化组蛋白 H3 Lys4 的富集。

结果图 2. 使用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 对 K562 染色质进行免疫沉淀。富集的 DNA 使用 Illumina GA2 测序仪进行测序。所获得的序列与 UCSC Human Genome Assembly (HG18) 比对,并使用集成式基因组浏览器 (IGB) 将数据可视化。(结果图 2A) 显示了染色体 8 三甲基化组蛋白 H3 Lys4 的富集。对于某个指定的 DNA 区域,升高的测序读取次数可用于检测富集的甲基化位点。结果图 2B结果图 2C 分别显示了激活 c-MYC 和 RPL30 基因的三甲基化组蛋白 H3 Lys4 的富集。

CST 非常感谢加州戴维斯加利福尼亚大学戴维斯分校的 H. O'geen 和 P.J. Farnham 分享他们的 ChIP 测序数据。

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