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经 ChIP-qPCR 验证的抗体

蛋白与 DNA 的相互作用介导许多不同的表观遗传过程。研究这些相互作用的研究人员需要一种可靠的方法,来分析它们何时在基因组中发生以及发生在何处。ChIP 被广泛用来分析特定基因和调节基因中的蛋白-DNA 相互作用。ChIP 结合定量 PCR (qPCR) 可以提供一种有效的工具,在较短周转时间内生成关于蛋白- DNA 相互作用的定量实时数据。

一次成功的 ChIP-qPCR 实验需要敏感性、特异性且每次都能提供可重复的结果的抗体。CST 严格地验证了推荐用于 ChIP-qPCR 的抗体,以确保符合生成可靠数据所需的高质量标准。

ChIP-qPCR 抗体验证步骤

  • 分析至少两 (2) 个已知阳性和一 (1) 个已知阴性的靶标位点的免疫富集情况,以确定抗体特异性。与已知阴性靶标位点相比,抗体对已知阳性位点必须显示最小富集倍数。
  • 使用 CST 的专有组蛋白肽阵列,进一步分析组蛋白甲基赖氨酸和甲基精氨酸抗体的抗体特异性。
  • 在抗体与同型对照比较中,分析已知靶标位点免疫富集的信噪比来确定抗体敏感性。抗体必须显示一个预先确定的最小信噪比,即靶标特异性抗体超过同型对照的靶标位点处最小可接受的富集倍数。
  • 在 ChIP 实验中,对每种抗体进行滴定来确定最佳性能。抗体太少或太多都不利于靶标位点的免疫富集。
  • 通过滴定新批次与前一批次来确定批间可重复性。
  • 使用已知阳性与阴性及野生型与敲除型细胞系来评估抗体特异性。
  • 使用能诱导胞核定位和/或与靶基因结合的细胞处理法来评估抗体特异性。
  • 在多种应用中测定抗体性能,以增强最终用户对抗体特异性的信心。
阳性/阴性基因位点(专题号 54062)

使用 SimpleChIP® 酶解染色质免疫共沉淀试剂盒(磁珠法) #9005 对 K-562 细胞的交联染色质与 p300 (D2X6N) 兔单克隆抗体 #54062正常兔 IgG #2729 进行染色质免疫沉淀。使用人源 STAT3 启动子引物、SimpleChIP® 人源 HNRNPA0 启动子引物 #83602SimpleChIP® 人源 MYT-1 外显子 1 引物 #4493 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品的免疫沉淀 DNA 含量,用染色质投入总量(相当于 1)相对应的信号进行表示。与 MYT-1 外显子 1 阴性位点相比,p300 (D2X6N) 兔单克隆抗体 在 STAT3 和 HNRNPA0 阳性位点的富集度 > 8 倍(比较 STAT3 和 HNRNPA0 阳性位点与 MYT-1 外显子 1 阴性位点的蓝条高度)。

组蛋白肽阵列验证(专题号 9733)

组蛋白肽阵列检测表明,Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) 兔单克隆抗体 #9733 对三甲基化组蛋白 H3 赖氨酸 27 具有特异性,并且不受邻近精氨酸 26 残基甲基化的影响。

阳性/阴性基因位点(专题号 54062)

使用 SimpleChIP® 酶解染色质免疫共沉淀试剂盒(磁珠法) #9005 对 K-562 细胞的交联染色质与 p300 (D2X6N) 兔单克隆抗体 #54062正常兔 IgG #2729 进行染色质免疫沉淀。使用人源 STAT3 启动子引物、SimpleChIP® 人源 HNRNPA0 启动子引物 #83602SimpleChIP® 人源 MYT-1 外显子 1 引物 #4493 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品的免疫沉淀 DNA 含量,用染色质投入总量(相当于 1)相对应的信号进行表示。与正常兔 IgG 在相同位点产生的背景富集度相比,p300 (D2X6N) 兔单克隆抗体 在 STAT3 和 HNRNPA0 阳性位点的富集度 > 50 倍(比较各靶标位点的蓝条和红条高度)。

敲除(专题号 #12721)

对经 DEM(50 μM,3 小时)处理的 MEF NRF2 野生型(左图)和 NRF2 敲除型(右图)细胞的交联染色质与 NRF2 (D1Z9C) XP® 兔单克隆抗体 #12721正常兔 IgG #2729 进行染色质免疫沉淀。使用小鼠 MafG 内含子 1 引物、SimpleChIP® 小鼠 NQO1 启动子引物 #12635SimpleChIP® 小鼠 RPL30 内含子 2 引物 #7015 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品的免疫沉淀 DNA 含量,用染色质投入总量(相当于 1)相对应的信号进行表示。正如预计的一样,NRF2 (D1Z9C) XP® 兔单克隆抗体 并没有在敲除型细胞(右图)中的 MafG 和 NQ01 阳性位点出现富集。

批间可重复性(专题号 5153)

使用 SimpleChIP® 内含子 #9005 对在无酚红培养基和 5% 活性炭剥离 FBS 中生长 3 天,随后用双氢睾酮 (DHT,10 nM) 处理 4 小时的 LNCaP 细胞的交联染色质进行染色质免疫沉淀。在本实验中,对第 3 批的雄激素受体 (D6F11) XP® 兔单克隆抗体 #5153 进行滴定,并与之前确定的第 2 批抗体的最佳稀释度 (1:100) 进行比较。使用 SimpleChIP® 人源 KLK2 内含子 1 引物 #62086SimpleChIP® 人源 KLK3 启动子引物 #32784SimpleChIP® 热源 α 卫星重复序列引物 #4486 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品的免疫沉淀 DNA 含量,用染色质投入总量(相当于 1)相对应的信号进行表示。如图所示,第 2 批和第 3 批的这种抗体在稀释度为 1:100 时显示出最佳性能。

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