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一致的 IHC 结果的解决方案:一抗和二抗、稀释剂、封闭液、色原、对照及其他

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抗体只是实验成功的因素之一。选择帮助抗体展现最好表现的配套产品同样重要。CST 提供的配套产品与我们科学家用于验证免疫细胞化学 (IHC) 一抗的试剂相同。为与我们的一抗和实验步骤配套使用,这些产品已经过全面优化,所以您完全可以相信您的结果。若要浏览全部 IHC 配套产品,请点击这里

免疫细胞化学 (IHC) 检测成功的关键元素

抗原修复

因为固定时形成的化学交联可通过阻止抗体与抗原接触来防止抗体结合;因此,须通过称为抗原修复(也称为抗原暴露或抗原表位修复)的过程来解交联。抗原修复可通过热诱导的方法(热诱导抗原表位修复或 HIER)或者通过酶解法实现。在抗体验证过程中,CST 为每个一抗确定了最佳流程,并将此信息纳入产品数据表。SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) #14746SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747 是 CST 针对抗原修复提供的两种选择。

封闭液

Normal Goat Serum #5425 是发色和荧光 IHC 应用的理想封闭剂。含 Tween® 20 (TBST-10X) #9997 的缓冲盐水和 Animal-Free Blocking Solution (5X) #15019 也可供使用。请参阅产品专属数据表获取您关注抗体的最佳缓冲液。

一抗孵育

一抗在任何 IHC 测定中都至关重要,对数据质量存在直接影响。质量较差的一抗可导致结果无法解释或存在误解。对于批准用于 IHC 的抗体,需要在单一组织样品超过一次染色阳性。来自 CST 的抗体经过严格的检测过程,可确保其可精确地检测到靶标。如要浏览我们经过严格验证的 IHC-P 抗体,请点击这里

抗体稀释剂可显著影响信号强度。SignalStain® Antibody Diluent #8112 在用作推荐抗体的稀释剂时可提供更好的染色。请务必通过搜索这里的 IHC-P 验证抗体查阅针对各一抗开发的产品专属实验步骤,从而确定您关注靶标的推荐稀释剂 。

IHC 抗体稀释剂44074060

抗体稀释剂可显著影响信号强度。 在用 SignalStain® Antibody Diluent (左图)或 TBST/5% NGS(右图)稀释后,利用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060Phospho-EGF Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb #4407 对石蜡包埋人乳腺癌(上图)和 HCC827 异种移植物(下图)进行的 IHC 分析。如图所示,与用 TBST/5% NGS 稀释相比,#4060 经 SignalStain®Antibody Diluent 稀释所得信号强度更强 。相比之下,#4407 在用 TBST/5% NGS 稀释时的效果更好。请查阅产品数据表中针对所选特异性抗体的推荐稀释剂。

阳性和阴性对照

您已经使用了您的抗体并获得了信号,但是它是特异性信号吗?阳性和阴性对照可为您确定自己的抗体正在检测预定靶标注入信心。在检测组织之前,利用各种细胞系和处理条件在细胞水平上评估抗体在 CST 的表现。例如,利用阳性表达和阴性表达的细胞系评估总蛋白质的特异性。此外,细胞也可由已知可引发信号变化的生物或化学调节剂进行处理,以验证修饰特异性,如磷酰化、乙酰化、裂解等。可通过磷酸酶处理对磷酸化特异性抗体做进一步评估。此外,因 Fc 受体结合或其他蛋白质与蛋白质相互作用,同型对照抗体有助于排除一抗的非特异性染色;而且,作为检测抗体,同型对照抗体应有相同的免疫球蛋白类型。点击这里浏览 IHC 对照切片。

IHC 对照信号强度

恰当的对照是确保特异性信号的必要的环节。 Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb #4370 与竞争者的 IHC 认证的 phospho-p44/42 (Tyr202/Tyr204) 抗体进行对比。分别评估各抗体的最佳稀释比例,以使抑制剂 U0126 (左图)处理的 NIH/3T3 细胞(A)中的非特异性染色度最低,使经激活剂 TPA #4174(右图)处理的 NIH/3T3 细胞中的特异性信号强度最高。在石蜡包埋人卵巢癌(B)的 IHC 分析中使用为各抗体确定的最佳稀释比例。注意:在所推荐的稀释比例下,竞争者的抗体对经抑制剂处理的细胞 (NIH/3T3 + U0126) 进行了染色 。在 CST 确定的最佳稀释比例下,竞争者的抗体不仅没有对经抑制剂处理的细胞进行染色,而且也未明显对组织进行染色。CST 抗体精确地对细胞和组织进行了染色。

洗涤

在我们 IHC-P 验证的抗体实验步骤中,CST 科学家使用含Tween® 20 (TBST-10X) #9997的 Tirs 缓冲盐水获得理想的洗涤条件。

检测

SignalStain® Boost IHC Detection Reagents #8125#8114 是高度敏感的不含生物素的基于聚合物的试剂,可避免由内源性生物素引起的背景染色。SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125SignalStain® Boost IHC Detection reagent (HRP, Rabbit) #8114可分别在 IHC 检测中用于检测小鼠或兔一抗。

并非所有 DAB 底物均可达到同等的效果。SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 敏感性高,与我们一抗配合使用的效果良好。

IHC 聚合物生物素检测

基于聚合物的检测比基于生物素系统更敏感。 利用S6 Ribosomal Protein (54D2) Mouse mAb #2317 和基于生物素检测(左图)或基于聚合物检测(SignalStain® Boost IHC Detection Reagent #8125;右图)对石蜡包埋的人肺癌进行的 IHC 分析。如图所示,基于聚合物的检测敏感度更高,染色强度更好。

IHC DAB 底物 9145 8059

并非所有 DAB 底物均可达到同等的效果 。利用 Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb #9145 对石蜡包埋的人乳腺癌进行的 IHC 分析 。使用SignalStain® DAB Substrate Kit #8059(上图)或另一家公司提供的 DAB(下图)进行显色法检测。SignalStain® DAB Substrate Kit 产生的信号比另一家公司提供的 DAB 更强。

封固及检查

使用 SignalStain® Mounting Medium #14177 确保玻片封固和储存的最佳条件。

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