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PTMScan Discovery 蛋白质组学服务工作流程

PTMScan® Discovery 能够在单次 LC-MS/MS 检测中发现数百至数千新的翻译后修饰 (PTM) 位点。

PTMScan Discovery 特性

  • 使用 CST 开发的 PTM 与基序抗体对含 PTM 肽进行抗体富集
  • 用于定量分析经富集肽的 LC-MS/MS
  • 可用于多种不同物种的样本,包括但不限于人类、小鼠、大鼠、果蝇、拟南芥等

如果您希望自己进行肽富集和 LC-MS/MS,请查看我们的 PTMScan 抗体试剂盒列表。

通过 CST 生产并就多种应用经内部验证的修饰位点特异性和总蛋白抗体,可继续研究 PTMScan Discovery 服务中已识别的大量候选蛋白质。

UbiScan® - 泛素化蛋白质组学

UbiScan 过程

蛋白质泛素化参与许多细胞过程,例如蛋白酶体降解、内吞、DNA 修复、细胞周期调控及基因表达等。而在癌症、神经退行性疾病、代谢综合征等疾病中,则会出现异常泛素化。

用于泛素化蛋白质组学的 UbiScan® 技术使用专利抗体来靶向胰蛋白酶消化后遗留在泛素化赖氨酸残基上的二甘氨酸残基 (K-ε-GG)。该泛素残基基序抗体可在对数千个非冗余的泛素化序列进行 LC-MS/MS 定量分析之前,用于富集胰蛋白酶消化样品中的泛素化肽。(其他泛素样修饰也会留下 K-ε-GG 残基,例如,NEDD8 和 ISG15。)

观看网络研讨会查看使用 K-ε-GG 残基基序抗体的 PTMScan 技术如何应用于大规模泛素化组学定量分析的示例。

UbiScan 蛋白质组学服务

靶标描述 基序 参考数据
靶标描述 基序 参考数据
泛素化残基 K-ε-GG 小鼠肝脏|XLS|RAW

SUMOScan™ - SUMO 化蛋白质组学

小泛素样修饰物 (SUMO) 蛋白是能够通过在赖氨酸残基上共价结合来可逆地修饰靶蛋白的小蛋白。蛋白 SUMO 化在许多细胞进程中发挥关键作用,如:

  • 核转运
  • DNA 复制和修复
  • 有丝分裂
  • 信号转导

针对 SUMO 化蛋白质组学的 SUMOScan™ 技术使用专有抗体来使 WaLP 消化样品的 SUMO 化肽达到丰富状态。WaLP 是一种对苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸和丝氨酸均有特异性的唯一蛋白酶,会在 SUMO 羧基末端的脂肪族残基上进行剪切,从而产生双甘氨酸 (K-ε-GG) 残迹,这种残迹会示踪在 SUMO 化底物的赖氨酸残基上。随后使用针对泛素分析而开发出的方法(UbiScan® 技术)便可识别包含 K-ε-GG 的肽(图 1)。因此,分别使用 WaLP 或胰蛋白酶消化样品可对相同样品进行 SUMO 和泛素特征分析。

特定 SUMO-蛋白酶(SENP 1 和 2)可用于验证使用 SUMOScan™ 技术识别的 K-ε-GG 位点源自 SUMO 化,而非泛素化 (图 2)。这可确保泛素化肽不会污染 SUMO 化样品。

SUMOScan™ 示意图

使用 K-ε-GG remnant motif antibody 对 SUMO 化肽(左图)和泛素化肽(右图)进行富集的策略示意图。

SUMOScan™ K-ε-GG 肽

对经 SENP 1 和 2 处理的 SUMO 化蛋白 (A) 和泛素化蛋白 (B) 的 K-ε-GG 肽进行定量分析所获得结果的柱状图。处理后,SUMO 化肽减少,而泛素化肽不变,这与蛋白质印迹实验数据一致。

MethylScan® - 甲基化蛋白质组学

MethylScan 过程

不同甲基化抗体及其靶标修饰的表示。

蛋白质甲基化是一种常见的翻译后修饰 (PTM),主要发生在精氨酸和赖氨酸残基中。精氨酸甲基化可调控 RNA 加工、基因转录、DNA 损伤修复、蛋白质转位及信号转导等过程。赖氨酸甲基化最众所周知的作用是调控组蛋白功能,此外还参与基因转录的表观遗传调节。

MethylScan® 甲基化蛋白质组学技术使用专有的甲基化精氨酸 (Me-R) 或甲基化赖氨酸 (Me-K) 抗体来富集蛋白酶消化样品中含甲基化成分的肽。CST 的甲基化抗体经过严格测试,包括肽封闭实验和肽阵列等测试,以确认特异性和灵敏度。每一种试剂都以最佳的方式进行设计和配制,目的是仅分别识别其甲基化精氨酸和甲基化赖氨酸残基的形式。

查看论证 MethylScan® 甲基化蛋白质组学的出版物。

MethylScan 点阵

小鼠脑和胚胎中的精氨酸单甲基化定量分析:散点图上的各点表示使用 PTMScan® Mono-Methyl Arginine Motif [mme-RG] Kit #12235 识别独特的精氨酸单甲基化肽。X 轴是小鼠脑和胚胎中甲基化位点的代表性肽总强度的 log10 值,Y 轴显示小鼠脑与胚胎中肽强度的 log2 比率。采用设定 5 倍作为临界值,来表示脑(绿点)或胚胎(红点)中升高的精氨酸单甲基化肽丰度。对于特异性组织中特有的甲基化肽,分配 15(脑特异性)和 -15(胚胎特异性)任意 log2 比率。数个代表性的脑与胚胎富集蛋白质在图表中高亮显示。

MethylScan® 蛋白质组学服务

靶标描述 基序 参考数据
靶标描述 基序 参考数据
Mono-Methyl Arginine R-Me 小鼠胚胎|XLS|RAW
Asymmetric Di-Methyl Arginine R-2Me(a)
Symmetric Di-Methyl Arginine R-2Me(s)
泛甲基赖氨酸 K-Me、K-2MeK-3Me

AcylScan™ - 酰化蛋白质组学

Acylscan 工作流程
Acylscan 文氏图

分析野生型和 Sirt5 敲除小鼠体内肝脏肽中的赖氨酸酰化:文氏图显示使用四种指定的酰化特异性抗体所识别的位点叠加程度 (B)。点击此处查看完整的数据集。

由于带正电荷的 ε 氨基侧链,赖氨酸残基会受到各种不同翻译后修饰的调控。从代谢中间产物乙酰辅酶 A、琥珀酰辅酶 A、丙二酰辅酶 A、丁酰辅酶 A、丙酰辅酶 A 及巴豆酰基辅酶 A 中转移的酰基全都会中和赖氨酸的正电荷,然后造成影响底物蛋白功能的结构改变。受酰化调控的细胞功能,包括细胞周期调控、线粒体代谢、细胞骨架调节、蛋白质间的相互作用及其他功能。

AcylScan™ 酰化蛋白质组学技术使用专有的乙酰化赖氨酸 (Ac-K)、乙酰化赖氨酸 (Glut-K)、丙二酰化赖氨酸 (Mal-K)、丙酰化赖氨酸 (Prop-K) 和琥珀酰化赖氨酸 (Succ-K) 抗体,在进行 LC-MS/MS 分析之前富集胰蛋白酶消化样品中各自含酰基的肽。

AcylScan™ 服务

服务 靶标描述 基序 参考数据
服务 靶标描述 基序 参考数据
AcetylScan® Acetyl-Lysine Ac-K 小鼠肝脏|XLS|RAW
GlutarylScan™ Glutaryl-Lysine Glut-K
MalonylScan™ Malonyl-Lysine Mal-K
PropionylScan™ Propionyl-Lysine Prop-K
SuccinylScan™ 琥珀酰化赖氨酸 Succ-K

PhosphoScan® 磷酸化蛋白质组学

PTMScan Discovery 工作流程

蛋白激酶可逆添加磷酸基,以激活或抑制蛋白质功能。磷酸化信号级联放大,例如 MAP 激酶信号转导通路,对于从细胞外部传递信息至细胞内部、最终在细胞里进行基因转录调控至关重要。异常磷酸化广泛存在于诸如癌症、糖尿病与神经退行性疾病等疾病中。因此,识别出蛋白质的磷酸化状态,对于了解健康状态和疾病状态下的细胞过程十分关键。

将 PhosphoScan® 蛋白质组学应用于

  • 通路分析
  • 生物标记物发现
  • 靶标验证

为什么在磷酸化蛋白质组学中需要考虑抗体富集?

  • 与 IMAC 相比,更关注于发现基于氨基酸 (S/T/Y) 或目标基序的磷酸化位点。
  • PTMScan® 方法与 IMAC 富集不同的磷酸肽池,使之高度互补。为了获得最完整的数据集,客户应该使用两种富集类型。查看数据
PTMScan Discovery 点阵

在 MKN-45 细胞中的酪氨酸磷酸化。MKN-45 细胞中的肽,在使用 DMSO(对照)、1 μM SU11274 或 200 nM Staurosporine #9953 处理 2 小时后,使用 PTMScan® Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) Kit #8803(上图)进行富集。同时,通过 LC-MS/MS 检测未经富集的材料,分析总蛋白水平(下图)。经 SU11274 或 Staurosporine 处理而丰度减少的肽用红色表示,经过处理后丰度增加的肽用绿色表示。右侧显示每个富集的分析重复测量次数的 A % CV 直方图,中位值 % CV 用蓝色表示。

PhosphoScan 服务

注:可针对服务定制丝氨酸/苏氨酸基序抗体组合。敬请咨询

靶标描述 基序 参考数据
靶标描述 基序 参考数据
14-3-3 结合基序 (R/K)XX(s/t)XP
Akt 底物 RXX(s/t) 小鼠肝脏|XLS|RAW
Akt 底物 RXRXX(s/t) 小鼠肝脏|XLS|RAW
AMPK 底物 LXRXX(s/t) 小鼠肝脏|XLS|RAW
ATM/ATR 底物 (s/t)Q 小鼠肝脏|XLS|RAW
ATM/ATR 底物 (s/t)QG 小鼠肝脏|XLS|RAW
CDK 底物 (K/R)(s/t)PX(K/R)
CK2 底物 (s/t)(D/E)X(D/E)
MAPK/CDK 底物 PX(s/t)P, (s/t)PX(K/R) 小鼠肝脏|XLS|RAW
PDK1 对接基序 (F/K)XX(F/Y)(s/t)F/Y) 小鼠肝脏|XLS|RAW
PKA 底物 (K/R)(K/R)X(s/t) 小鼠肝脏|XLS|RAW
PKC 底物 (K/R)X(s/t)X(K/R) 小鼠肝脏|XLS|RAW
PKD 底物 LXRXX(s/t)
PLK 结合基序 S(s/t)P 小鼠肝脏|XLS|RAW
tP 基序 (s/t)P, (s/t)PP
tPE 基序 (s/t)PE 小鼠肝脏|XLS|RAW
tXR/tPR 基序 (s/t)XR, (S/t)PR 小鼠肝脏|XLS|RAW
Phospho-Tyrosine (pY-1000) y 小鼠脑|XLS|RAW

Caspase 剪切底物蛋白质组学

内源性和外源性细胞凋亡通路会涉及 Caspase 的级联放大反应。人类蛋白质组中包含数千个已知或假定的 Caspase 剪切位点。大多数 Caspase 底物是在天冬氨酸残基上进行剪切的,这会生成带 DEXD 基序的含天冬氨酸羧基端的众多片段,其中会一些不同。

针对 Caspase 剪切蛋白质组学的 PTMScan® 技术使用靶向 DEXD 基序的专有抗体,可在进行 LC-MS/MS 之前对胰蛋白酶消化样品中已剪切的 Caspase 底物肽进行富集。

Caspase 测序

Caspase 剪切底物蛋白质组学:该基序标识是在 PTMScan® LC-MS/MS 实验中生成的,期间使用来自 Hela 细胞(经 Staurosporine #9953 处理以诱导细胞凋亡 [1 μM,3 小时])的含天冬氨酸羧基端的1044条非冗余性胰蛋白酶肽。这些肽使用了 PTMScan® Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] Kit #12810 进行富集。该标识表示各位置上氨基酸引导至天冬氨酸羧基端的相对频率。

Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab 蛋白质印迹法

Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab® Rabbit mAb mix #8698:未经 (-) 或经 Staurosporine #9953 处理(1 μM,3 小时;+)的 NIH/3T3 与 Hela 细胞的蛋白质印迹法分析将 Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] MultiMab® Rabbit mAb mix(上图)或 GAPHD (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174 作为上样对照(下图)。

Caspase 剪切底物蛋白质组学服务

靶标描述 基序 参考数据
靶标描述 基序 参考数据
已剪切的 Caspase 底物 DEXD

PTMScan® Discovery 在转化医学研究中的应用(一项案例研究)

从实验室到临床

PTMScan Discovery 工作流程(一项案例研究)

CST 针对非小细胞肺癌 (NSCLC) 中的酪氨酸激酶活性开展了一项整体研究,旨在发现新的致病因素 (1)。磷酸化酪氨酸抗体用于在 LC-MS/MS 分析前,对 41 种 NSCLC 细胞系和 150 种 NSCLC 肿瘤中的磷酸化肽进行富集。该分析在 4551 多个蛋白质上识别出 2700 个磷酸化酪氨酸残基。酪氨酸激酶间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 是前 10 种有待后续分析的候选产物之一。

EML4-ALK 融合

进一步的研究发现,在有某些 NSCLC 细胞系和肿瘤中 EML4(棘皮动物微管结合蛋白样 4)的 N 末端会与 ALK 的 C 末端发生融合。3-7% 的 NSCLC 患者的肿瘤中存在高度易致癌的融合蛋白 (1-4)。表达 EML4-ALK 融合蛋白的癌细胞对于小分子 ALK 抑制剂 Crizotinib 十分敏感,而且在 2011 年美国食品药品监督管理局 (FDA) 已批准将 Crizotinib 用于 ALK 阳性 NSCLC 的治疗 (2)。

CST 开发了一种高特异性和敏感性的抗体 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb #3633,它可以检测全长 ALK 和 EML4-ALK 融合蛋白。FDA 已批准了免疫组织化学法 (IHC) 伴随诊断测试,此项测试采用了 CST 授权的 ALK D5F3 克隆 (3)。这将帮助医生确定哪些 NSCLC 患者可以采用 Crizotinib 进行有效治疗。

ALK 表达的 IHC 分析

使用 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb #3633,对具有高水平(上图)与低水平的(下图)ALK 表达的石蜡包埋人类肺部肿瘤进行 IHC 分析。

参考文献

  1. Rikova K, Guo A, Zeng Q, Possemato A, Yu J, Haack H, Nardone J, Lee K, Reeves C, Li Y, Hu Y, Tan Z, Stokes M, Sullivan L, Mitchell J, Wetzel R, Macneill J, Ren JM, Yuan J, Bakalarski CE, Villen J, Kornhauser JM, Smith B, Li D, Zhou X, Gygi SP, Gu TL, Polakiewicz RD, Rush J, Comb MJ (2007) Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.Cell 131(6), 1190–203.
  2. FDA approves Xalkori with companion diagnostic for a type of late-stage lung cancer
  3. Ventana receives FDA approval for the first fully automated IHC companion diagnostic to identify lung cancer patients eligible for XALKORI® (crizotinib)
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